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研究背景播散浅表性光化性汗孔角化症(Disseminated superficial actinic porokeratosis, DSAP)是汗孔角化症中最常见的临床类型。表现为曝光部位为主的多重小的、环状、无汗的角化性皮损。中间萎缩,周边凸起的边嵴由角化不全细胞和角蛋白紧密排列的圆柱既角样板形成。角样板是汗孔角化症典型的病理学特征。研究显示遗传因素、紫外线照射,免疫抑制等与汗孔角化症的发病有关。DSAP表现为常染色体显性遗传模式。目前通过传统的连锁分析研究已报道了5个DSAP连锁位点：12q23.2-24,12q24.1-q24.2,15q25.1-26.1,1p31.3-p31.1和16q24.1-24.3。研究者对连锁区域内进行候选基因测序研究,虽然在DSAP家系中发现了SSH1和SART3基因的变异体,但是目前为止没有在另外DSAP患者中得到验证。目前汗孔家化症的基因缺陷和遗传学机制不清。目的(1)对一DSAP家系中的2个患者和1个对照进行全基因组外显子测序,经过逐步滤过和另外独立DSAP样本验证,筛选出DSAP的致病基因。(2)对致病基因进行功能学研究,进一步探究DSAP的发病机理。方法(1)在安徽医科大学第一附属医院皮肤科,中南大学湘雅医学院,山东省立医院皮肤科收集汗孔家化症病例和家系内成员。经过严格筛查,共有115个DSAP患者,31个家系内对照,11个其他类型的汗孔角化症患者纳入了本次研究。(2)利用Agilent SureSelect Human All Exon Kit对一个DSAP家系(家系1)中的2个患者和1个对照进行了全基因组外显子捕获,然后用HiSeq2000高通量测序仪进双末端测序。原始图像文件用Illumina basecalling Software1.7进行序列读取,将Reads序列通过SOAPaligner2.20比对到人类参照基因组(NCBI build36.3, hg18)上。(3)目标区域的基因型通过SOAPsnp (v1.03)来读取,要求Phred-like值≥20和测序深度≥4。不同于参照基因组的基因型被筛选出作为候选SNPs,另外,通过GATK流程来读取编码区域的插入或缺失。(4)对所有的变异体进行功能注释,分为错义突变、无义突变、通读突变、剪切位点突变、编码区插入或缺失、同义突变和非编码区突变。筛选出可能对基因功能有显著影响的非同义突变(Nonsy snonymous, NS)、剪切位点突变(Splice acceptor and donor site, SS)和编码区插入或缺失(Coding indels, I)。将2个患者的NS/SS/I在可得的公共数据库(dbSNP129,8个HapMap外显子组和千人基因组变异体数据库)中进行过滤,再跟1个对照进行过滤。筛选出2个患者共有,公共变异体数据库和1个对照没有的变异体作为候选变异体。再用ANNOVAR和GERP来评估这些候选变异体对基因功能的影响,结合以前报道的DSAP的连锁区域,筛选出DSAP可能的致病基因／变异。(5)对筛选出来的DSAP可能的致病变异体在家系1中的6个患者和3个正常人进行Sanger测序验证,筛选出与DSAP表型共传递的变异体。(6)对家系1中与DSAP表型共传递的变异体所在的基因,在另外的独立DSAP样本中进行基因所有编码外显子和侧翼区的Sanger测序,发现DSAP致病基因。(7)对所有DSAP致病基因突变在676个健康人的外显子组数据中筛查,排除多态性。(8)对5个Mibelli型汗孔角化症、2个线状汗孔角化症和4个播撒性浅表性汗孔角化症患者进行DSAP致病基因突变筛查研究。(9)免疫组织化学研究DSAP致病基因在正常皮肤中的表达。(10)单纯的真核表达载体(pcDNA),野生型MVK真核表达载体(Wild MVK),针对MVK的shRNA表达载体(MVK shRNA)或非靶向shRNA载体(No-Targeting control)转染到原代培养的皮肤角质形成细胞(KCs)48小时,建立体外MVK过表达及低表达的细胞模型,通过流式细胞术、实时定量PCR和Western-blotting、Caspase3活性检测的方法来检测MVK基因表达对角质形成细胞增殖、分化及凋亡的影响。(11)对5个DSAP患者进行激光显微切割技术分离出皮损角质形成细胞,然后进行MVK基因突变筛查。结果(1)家系1中3个个体的全基因组外显子数据通过与参照基因组比对、变异体读取及逐步过滤,得出2个患者共有、公共数据库和1个对照没有的104个候选变异体,其中只有1个(c.764T>C,MVK)被ANNOVAR和GERP同时预测有害且位于以前报道的DSAP的连锁区域。(2)家系1中的6个患者均携带该错义突变c.764T>C,但3个正常人均不携带,该突变与DSAP表型共传递。(3)在另外18个DSAP家系先证者和4个DSAP散发病例中检测到MVK基因的13种不同的突变,所有突变在676个健康人外显子数据中不存在,排除多态性。(4)11个其他类型汗孔角化症患者中没有发现MVK突变。(5)MVK蛋白在正常皮肤的角质形成细胞中有表达,主要在胞浆部位。(6)MVK的高表达促进Cacl2诱导的分化标记角蛋白1、内皮蛋白的表达增加,相同地shRNA引起的MVK低表达能够导致KCs的角蛋白1和内皮蛋白的表达量降低,角蛋白5的表达没有发生显著性的改变；流式细胞PI染色检测结果提示：在MVK低表达后S期细胞的比例轻度降低,而MVK过表达后S期细胞的比例轻度上升,但均没有统计学差异；Caspase3活性分析显示：MVK低表达后,其活性显著增高,而MVK过表达后caspase3的活性显著收到抑制。在早期凋亡的流式细胞分析中也发现,MVK的表达能够抑制紫外线诱导的凋亡。(7)在5个DSAP患者皮损的角样板角化不全细胞中验证了MVK生殖系突变,没有发现二次突变。结论(1)本文通过对1个DSAP家系中3个成员的全基因组外显子测序和其他独立样本的验证研究发现了DSAP的致病基因MVK。(2)MVK的表达与角质形成细胞的分化和凋亡有关,与增殖无显著相关。(3)本研究有助于明确DSAP发病机理,同时扩展了人类疾病发展中MVK基因多效性功能谱。