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低温是影响水稻生产的重要环境限制因素之一,其中苗期冷害会使植株枯黄、分蘖减少,严重时可引起植株生长发育迟缓,进而导致减产或绝收。了解水稻苗期冷害发生的分子机制,改良水稻的耐冷性和培育耐冷水稻新品种是解决低温对水稻生产影响的关键。植物耐受低温胁迫是一个系统的调控过程,需要众多基因参与。microRNA是长度为21nt左右的单链RNA分子,被证明参与许多生物学过程的调控。miR319被证明参与植物生长发育的调控,我们在前期的研究中,通过基因芯片分析发现,水稻miR319a/b在冷胁迫下差异表达,推测miR319a/b在水稻耐受低温胁迫时发挥作用。本研究对水稻幼苗进行低温胁迫处理,采用半定量RT-PCR方法,分析miR319表达特性,验证前期基因芯片分析结果。构建pre-miR319a/b植物表达载体,对水稻进行遗传转化,获得了pre-miR319a及miR319b超量表达水稻植株。对野生型水稻和过量表达植株进行胁迫处理研究miR319耐冷功能。利用psRNA Target软件预测miR319靶基因,并利用miR319b过量表达植株进行real-time PCR验证其靶基因。采用real-time RT-PCR方法,分析冷胁迫Marker基因表达,初步阐明miR319b调控植物耐冷的分子机制。主要研究结果如下：1.水稻冷胁迫相关miRNA的验证通过冷胁迫处理下的RT-PCR结果分析,miR319a/b在冷胁迫0.5h时下调表达,随着处理时间的增加表达量有所升高,在3h时以后,miR319a/b的表达量继而下降。RT-PCR验证了本实验室前期的芯片研究结果,显示了miR319a与miR319b是对冷胁迫具有响应。2. miR319在水稻中的过量表达及耐冷功能分析构建了融合有pre-miR319a/b的植物表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化的方法对水稻愈伤组织进行遗传转化。通过PCR、southern blot、RT-PCR对抗性植株进行了分子生物学检测,每个基因得到转基因植株3株以上,并利用stem-loop qRT-PCR检测miR319a/b成熟体在转基因植株中表达量,结果表明,转pre-miR319a基因植株miR319a表达量基本无变化；转pre-miR319b基因植株中miR319b的表达量明显提高。通过分析T2转基因及野生型植株在冷胁迫处理下的表型,结果表明：pre-miR319a转基因植株与野生型植株种子大小及在萌发1d-15d各阶段均无差异；在冷处理后,转基因水稻与野生型水稻的生长状况无明显区别。miR319b过量表达水稻的种子比野生型小,且萌发后15d幼苗miR319b过量表达植株明显比野生型植株低矮,第一片真叶至第二片真叶之间的节间变短,但是植株的生长并没有受到抑制；三叶期时,miR319b基因提高了水稻的耐冷性,成活率明显升高,脯氨酸含量升高。3.水稻miR319靶基因的预测及生物学验证通过miRNA靶基因预测软件工具psRNA Target,我们预测得到了26个miR319的靶基因;通过对过表达植株的定量分析验证了其中两个靶基因：Os03g57190（PCF6）和Os07g05720（OsTCP21）,这两个基因均属于TCPs转录因子家族。在已有的研究报道中,TCPs转录因子可以促进植物细胞的增殖,抑制细胞的分化。4. miR319b介导的冷胁迫应答分子机制通过对miR319b过表达植株与野生型植株冷胁迫相关Maker基因定量分析,我们发现在冷胁迫下一些关键的Maker基因如DREB/CBF类基因、TPPs等在过表达植株中上调表达,而OsCPT1基因下调表达。TPPs基因受冷胁迫诱导表达,可以直接的提高水稻的冷胁迫能力。DREB/CBF转录因子类基因在过量表达植株中转录水平提高,可以促使该类转录因子的表达,诱导下游冷胁迫应答基因的表达,提高水稻的耐冷性。miR319通过间接调控这些基因的表达,提高植物的冷胁迫耐性。OsCPT1基因一个是的DREB1A转录因子的靶基因。在OsMYB3R-2过量表达植株中,该基因在冷胁迫下诱导表达,脯氨酸含量升高,提高转OsMYB3R-2基因植株的耐冷性[108]。但是在本研究中,OsCPT1在miR319b过表达植株中表达量下降,而脯氨酸含量升高,这说明miR319b调控的的耐冷分子机制比较复杂,有待于我们深入的进一步研究