本研究以江苏省农业科学院培育的籼稻两用不育系812S中的1个农艺性状基本一致的叶片光氧化突变株系812HS为材料。江苏地区6月中下旬梅雨连绵,光照较弱,该突变体叶片正常绿色,7月中旬至8月上旬,在梅雨结束后的强烈阳光照射下,812HS叶片出现非常强烈的光氧化伤害,尤其是倒二、倒三叶出现明显的失绿现象,而野生型叶色则正常绿色。基因定位分析发现,该突变基因是位于第4染色体分子标记M22与M102之间约55.42kb区域内的一个新基因,暂命名为LPO1(t)(Leaf photo-oxidation 1)。本研究围绕812HS叶绿体结构和功能的变化,研究叶绿体光能吸收、转化和传递性能,并对整个生长发育时期的生理生化进程、尤其是光氧化发生期的蛋白质组分和转录组学进行了研究,对于阐明水稻叶片光氧化的分子遗传机理和指导水稻耐强光育种具有重要意义。研究结果如下:(1)812HS的表型随着光照强度增加,812HS中的总叶绿素含量逐渐减少,到8月4日,叶绿素含量明显下降,Chla/b值则从6月23日(光氧化尚未发生)开始到8月4日(光氧化现象最明显)逐渐增大,以后逐渐减小。部分遮阴处理显示,在弱光生长条件下,812HS和野生型的叶片均未出现光氧化现象,而对照(强光,气温同弱光条件)两者差异明显,证明自然条件下812HS发生叶片光氧化是由强光引起。对叶片叶绿素合成前体物质检测发现,可能是由Urogen Ⅲ至Proto Ⅸ阶段受阻导致叶绿素含量降低。利用透射电子显微镜观察叶绿体结构发现,6月23日突变体及其野生型的叶绿体结构均完整,类囊体片层堆叠整齐,基粒堆积致密、排列有序,并且有大小不等的淀粉粒(造粉体)存在。8月4日,812HS中的叶绿体已由梭形变为球形,叶绿体体积变大,基粒片层模糊,淀粉粒减少,出现嗜锇颗粒,甚至部分叶绿体的类囊体解体,而野生型叶肉细胞中叶绿体有大量淀粉粒积累,类囊体片层仍堆叠紧密,说明812HS叶绿体结构遭到严重破坏。(2) 812HS的光合性能叶绿素荧光诱导动力学曲线分析发现PSⅠ和PSⅡ存在紧密相互作用的逆境防御策略。强光主要是对812HS的放氧复合体造成伤害,从而影响光系统间的电子传递链。812HS主要是通过增加PSⅡ中热耗散相关参数(φD0、DIo/CSm和DI0/RC)来缓解光氧化对反应中心的伤害。PSⅡ光合性能指数PIABs和Fv/FM7月14日时较高,随着强光照时间的延长,到8月4日开始下降。8月4日时812HS的净光合速率明显降低,胞间二氧化碳浓度明显增加,光合磷酸化水平、ATP含量、Ca-ATPase和Mg-ATPase活性降低。另外,随着强光照时间的延长,812HS中的叶黄素循环库逐渐增加,V逐渐减少,A和Z含量随之增加,说明812HS在强光下通过叶黄素循环耗散过剩激发能来缓解对叶片的伤害,也进一步说明8月4日时812HS的能量代谢已经失衡。(3) 8月4日时812HS的RuBisCO酶活力下降,PEPCase和NADP-ME酶活性上升,推测可能是强光下C4光合代谢或者C4光合途径对RuBisCO酶活性下降或提前降解的补偿。非生物胁迫引起活性氧伤害主要来自于ROS的产生。强光下,812HS叶片中O2·-、H2O2、MDA含量逐渐增加。8月4日时812HS的SOD活性也增加,然而,O2·-产生更多,伤害可能是由于O2·-的产生速率超过了 SOD清除O2·-的能力的增加。另外,SOD活性随着衰老在9月15日时显著降低,虽然POD、CAT、APX和GR活性略微增加,仍然导致H202积累,叶绿体膜的结构受损以及黄化失绿表型证实了这一点,这些结果都说明8月4日时812HS的抗氧化酶系统已经失去了本身的平衡。(4)利用双向电泳技术对8月4日的812HS与野生型叶片的差异蛋白进行分析,成功鉴定了 56个差异表达蛋白点中的53个,涵盖了大范围的生物功能与代谢通路。与野生型相比,812HS中有32蛋白点上调,21个蛋白点下调(P<0.05,1.5-4.9倍)。这些差异蛋白按照功能可以分为9组,主要是与光合作用(30.43%)、呼吸和能量代谢(16.67%)、抗性(17.39%)、蛋白储存或降解(13.04%)相关,剩下的一些是功能未知蛋白(13.04%)。亚细胞定位分析发现,这53个蛋白质位于叶绿体(50%)、线粒体(5.76%)、细胞质(11.54%)、细胞膜(7.69%)和过氧化物酶体(1.92%),还有23.09%的具体位置未知。在强光照射下,光合作用相关蛋白RuBisCO大亚基和大链前体上调,其活化酶下调,导致光合作用减弱。同时,消除活性氧等有害物质的过氧化物酶类蛋白和防御相关蛋白在812HS中也表达上调,表明这些蛋白在水稻光氧化代谢方面起重要作用。(5)通过差异倍数(|log2 (Fold change)|> 1)和显著水平(q_value<0.05)挑选出转录组表达差异基因,发现基于野生型在812HS基因表达谱2540个差异基因中有1342个基因上调,1198个基因下调。对Cuffdiff找到的差异基因进行KEGG代谢通路分析发现,共有546个Unigenes参与到21条KEGG代谢通路中。其中,代谢和遗传信息处理是两个富集丰富的代谢通路,磷酸戊糖途径、淀粉和蔗糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、柠檬酸循环糖酵解/糖异生、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、光合生物中的碳固定、光合作用、苯丙素生物合成、芳香化合物的降解、碳代谢、氨基酸的生物合成以及代谢途径包含在代谢通路。核糖体、RNA转运、剪接体以及蛋白质在内质网中的加工包含在遗传信息处理类。此外,一些重要的通路也明显富集,例如机体系、细胞过程和环境信息处理。这些结果暗示,参与到这些通路的基因在光氧化条件下起到关键作用。本研究结果为拓展对光氧化的进程、功能和途径的理解提供了新的科学信息。