家蝇中免疫及抗菌活性物质的分离与纯化

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本论文对家蝇的养殖、血淋巴中抗菌及免疫活性物质凝集素的诱导及分离纯化进行了较为系统的研究,为进一步开发和利用家蝇凝集素及其他免疫活性物质提供了条件和依据。 确定了家蝇饲养的最佳条件。卵的饲料为麦麸:奶粉:水为100:1:200,温度为24~28℃,水分含量为60~70%;幼虫的饲料为麦麸:奶粉:水为100:1:200,温度24~28℃,水分含量为60~70%;蛹:温度26~30℃,湿度40~50%(空气);成蝇的饲料为红糖:奶粉=1:1,温度26~30℃,湿度50~60%(空气)。 通过刺伤、超声波、大肠、紫外线四种诱导方式诱导三龄幼虫和蛹。确定了针刺为最终诱导方案,并取诱导后48小时的蛹为实验材料。 凝集素的粗提确定提取溶液为昆虫生理盐水,提取时间为1hr,提取的料液比为1:2。 亲和层析法纯化凝集素。亲和层析所用的填料为琼脂糖4B,层析柱长为36cm,层析柱直径为1.1cm,上样量为2mL,用BIS缓冲液洗脱杂蛋白至A280<0.02,再用0.3M半乳糖溶液洗脱凝集素至A280<0.02,流速为3mL/10min。 戊二醛固定化兔血细胞纯化凝集素步骤:洗涤新鲜兔血得血红细胞→戊二醛固定兔血红细胞→兔血红细胞与蝇蛆粗提液混合,吸附,离心→沉淀物与半乳糖溶液混合,解吸,离心→上清液透析→冷冻干燥 采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶浓度为10%。 考马斯亮蓝染色后亲和层析法纯化的样品有4条蛋白带,它们的分子量分别为56.5KD,33.3KD,27.9KD,23.44KD,四条蛋白带可能为凝集素分裂的亚基。兔血红细胞吸附法纯化的样品有6条蛋白带,其中33.3KD的蛋白带与层析法纯化的蛋白带一致。因此本论文推论33.3KD的蛋白带为家蝇的凝集素,此结果与有关报道一致。 家蝇的凝集素对兔和小白鼠的红细胞有凝血现象,且家蝇凝集素对兔的凝血活力高于对小白鼠的凝血活力。凝集素对兔血红细胞的凝血效价为256。半乳糖对家蝇凝集素凝血有专一性抑制,半乳糖为家蝇凝集素专一性结合的糖。葡萄糖、蔗糖、果糖对家蝇凝集素凝血无抑制作用。
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