目的:根据国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation,IDF）统计,2021年世界范围内患糖尿病的人口约为5.37亿人,但该数字将在2045年快速增至7.84亿。糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病最常见且最严重的慢性微血管并发症之一,DKD作为一种复杂的多基因疾病,多基因相互作用与表达调控常影响疾病的发生发展。其中表观遗传学调控基因转录和翻译,已成为参与糖尿病肾病发生发展的重要机制之一。众所周知,RNA受到多种修饰,其中内部修饰在RNA代谢中起着重要作用。最丰富的内部RNA修饰是N6-甲基腺苷（m~6A）。m~6A甲基化修饰是新兴的表观遗传调控机制,在1970年代首次发现,RNA修饰的最新进展已经确定了N6-甲基腺苷（m~6A）在nc RNA代谢和生物学过程中的关键作用。m~6A修饰最好发生在共有基序RRACH（R=G或A;H=A,C或U）中。m~6A修饰机制由“编辑器”、“擦除器”和“阅读器”组成,它们经过精确的平衡以支持正常的细胞功能。m~6A修饰在多种生物过程中发挥重要作用,例如肿瘤发生、脂肪代谢、糖代谢、生物节律、生殖发育、免疫调节、病毒复制、心肌重塑和应激反应等。然而,m~6A在DKD发病机制中的作用研究尚不完全清楚。大量研究发现,m~6A修饰不仅在m RNA中起作用,还调节非编码RNA（例如mi RNA,lnc RNA和circ RNA）的产生和功能。研究表明m~6A修饰可能通过提供m~6A阅读器蛋白的结合位点或通过调节局部RNA的结构以诱导RNA结合蛋白进入而调节lnc RNA的功能。长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA（lnc RNA）涵盖了一大类转录的RNA分子,有特异性,总体上保守性很差,并以低水平表达。lnc RNA具有多种作用模式,也是重要的转录调节因子。lnc RNA在表观遗传调控、基因转录、基因翻译和m RNA加工中至关重要,调节多种生物过程,包括体内平衡、细胞代谢、增殖、凋亡和分化。研究表明,TUG1在许多人类肾脏病中发挥重要作用,lnc RNA TUG1与Ppargc1a启动子区域上游的lnc RNA TUG1结合位点相互作用,触发Ppargc1a m RNA的转录增加,再通过靶向由Ppargc1a编码的转录因子PPARγ共激活因子1α（PGC-1α）来调节足细胞中的线粒体功能。PGC-1α水平降低会导致线粒体功能受损会导致能量耗竭,活性氧（ROS）生成增加,并最终导致糖尿病肾病的发展。课题组前期使用Arraystar m~6A单碱基分辨率芯片方法发现高糖培养的HK-2细胞中lnc RNA TUG1的m~6A水平降低。根据转录本全长序列,发现在HK-2细胞中lnc RNA TUG1存在4个m~6A位点,小鼠对应的11号染色体上lnc RNA TUG1中存在2个相同的m~6A位点。本研究目的是分析高糖培养的HK-2细胞中RNA m~6A修饰的生物学规律,探究RNA m~6A甲基化/去甲基化动态调控失衡是否参与糖尿病肾病的发生和发展;探讨lnc RNA TUG1的m~6A修饰机制,并且明确lnc RNA TUG1的m~6A修饰水平变化是否造成lnc RNA TUG1在高糖诱导的HK-2细胞中的表达变化,以及靶向调控参与肾脏lnc RNA TUG1 m~6A修饰的甲基化调控酶是否可以通过调控下游靶基因PGC-1α的转录,改善线粒体功能障碍,减轻糖尿病肾脏损伤。方法:第一部分:比色法检测人近端肾小管上皮细胞（HK-2）中总RNA的m~6A修饰水平,Western Blot、RT-q PCR检测HK-2细胞中m~6A修饰相关调控酶的表达。第二部分:Maz F-实时定量PCR对HK-2细胞中lnc RNA TUG1的四个m~6A位点分别检测m~6A修饰水平,RT-q PCR检测HK-2细胞中lnc RNA TUG1的表达,RIP（RNA immunoprecipitation）-PCR检测lnc RNA TUG1是否可以结合METTL3、IGF2BP2,RT-q PCR检测TUG1的RNA衰变降解。第三部分:比色法检测HK-2细胞和小鼠肾组织中总RNA的m~6A修饰水平,Western Blot、RT-q PCR检测小鼠肾组织m~6A修饰关键调控酶的表达。Western Blot、RT-q PCR和免疫组化法检测HK-2细胞和小鼠肾组织中PGC-1α及下游靶标,包括Nrf1、Nrf2、TFAM的表达。RT-q PCR检测HK-2细胞和小鼠肾组织线粒体DNA含量的表达,紫外分光光度法测定HK-2细胞、小鼠肾组织中线粒体ATP含量和线粒体呼吸链复合体I、II、III、IV的活性,Mito SOX Red检测HK-2细胞产生的ROS的水平,流式细胞仪检测HK-2细胞不同刺激下HK-2细胞凋亡的情况。透射电镜观察HK-2细胞及小鼠肾组织中线粒体形态及肾组织中足突改变。结果:第一部分:高糖培养的HK-2细胞中总RNA的m~6A修饰水平明显下降,甲基转酶METTL3的表达下调,修饰识别蛋白YTHDF1的表达明显上调,而修饰识别蛋白IGF2BP2的表达明显下调,去甲基化酶FTO、甲基转移酶METTL14、修饰识别蛋白YTHDF2变化无统计学差异。第二部分:高糖培养的HK-2细胞中lnc RNA TUG1的2047、4944位点上m~6A修饰水平明显下调,lnc RNA TUG1的表达水平下降。RIP-PCR分析表明lnc RNA TUG1是可以结合METTL3,并且表明METTL3可以富集lnc RNA TUG1的表达,过表达甲基转移酶METTL3可使HK-2细胞中总RNA的m~6A修饰水平明显上调,并且lnc RNA TUG1的2047、4944位点上m~6A修饰水平明显上调。RIP-PCR分析表明IGF2BP2可识别m~6A修饰的lnc RNA TUG1并富集lnc RNA TUG1的表达,高糖刺激可缩短lnc RNA TUG1的半衰期,降低它的稳定性,而IGF2BP2可延长lnc RNA TUG1的半衰期,提高它的稳定性。第三部分:在正常糖或高糖培养的HK-2细胞中过表达METTL3可使PGC-1α、Nrf1、Nrf2、TFAM的蛋白和m RNA水平明显上调,线粒体DNA含量、ATP含量、线粒体呼吸链复合体I活性和线粒体呼吸链复合体III活性明显上调,ROS产生及细胞凋亡显著减少,线粒体形态学损伤减轻,在共转染lnc RNA TUG1的si RNA后,PGC-1α、Nrf1、Nrf2、TFAM的蛋白和m RNA水平明显下调,线粒体DNA含量、ATP含量、线粒体呼吸链复合体I活性和线粒体呼吸链复合体III活性明显下调,ROS产生及细胞凋亡显著增加,线粒体形态学损伤加重。与db/m小鼠相比,db/db小鼠肾组织中的m~6A修饰水平明显降低,Western Blot、RT-q PCR和免疫组化法分析表明甲基转酶METTL3、修饰识别蛋白IGF2BP2的表达明显上调,血糖、体重、血肌酐、尿微量白蛋白/尿肌酐比值的水平明显升高,血浆白蛋白的水平明显降低,尿素氮无明显变化;而与db/db小鼠相比,注射AAV-METTL3过表达后,db/db小鼠肾组织的m~6A修饰水平明显升高,甲基转移酶METTL3、修饰识别蛋白IGF2BP2的表达明显上调,血糖、体重、血肌酐、尿微量白蛋白/尿肌酐比值的水平明显降低,血浆白蛋白的水平明显升高,而尿素氮无明显变化。HE染色显示与db/m小鼠相比,db/db小鼠肾脏的肾小球肿大、扩张,肾小球透明样变性、肾小管扩张,PAS染色显示与db/m小鼠相比,db/db小鼠肾脏的肾小球系膜基质增多,系膜基质扩张,基质阳性面积比值增加,Masson染色显示db/db小鼠肾脏的肾小球细胞外基质积累、胶原蛋白的沉积和肾小管间质纤维化程度,间质损伤评分升高,而METTL3过表达可减轻高糖引起的肾脏损伤。与db/m小鼠相比,db/db小鼠肾组织和血清中lnc RNA TUG1的表达水平明显下调,Western Blot、RT-q PCR和免疫组化法分析表明PGC-1α、Nrf1、Nrf2、TFAM的水平显著下调,线粒体DNA含量、ATP含量、线粒体呼吸链复合体I活性和线粒体呼吸链复合体III活性明显下调,线粒体形态学损伤加重、足突融合,而与db/db小鼠相比,注射AAV-METTL3过表达后,db/db小鼠肾组织和血清中lnc RNA TUG1的表达水平明显上调,PGC-1α、Nrf1、Nrf2、TFAM的水平明显上调,线粒体DNA含量明显上调、ATP含量明显升高、线粒体呼吸链复合体I活性和线粒体呼吸链复合体III活性明显上调,线粒体形态学损伤及足突病变减轻。结论:第一部分:高糖培养的人近端肾小管上皮细胞中m~6A修饰水平明显下调,RNA m~6A修饰水平可能主要受甲基转移酶METTL3的调控,RNA m~6A甲基化/去甲基化动态调控失衡可能参与糖尿病肾病的发生和发展。第二部分:高糖状态下lnc RNA TUG1的m~6A修饰水平下降,导致lnc RNA TUG1在HK-2细胞中的表达水平下降,甲基转移酶METTL3能够通过调控TUG1的m~6A修饰以IGF2BP2依赖的方式上调HK-2细胞中lnc RNA TUG1的表达。第三部分:METTL3通过lnc RNA TUG1 m~6A修饰上调lnc RNA TUG1的表达,靶向调控PGC-1α通路改善高糖诱导的HK-2细胞线粒体呼吸链复合体I、III活性,增加线粒体DNA含量及ATP含量,减少活性氧的产生,减轻线粒体形态学改变及细胞凋亡;改善db/db小鼠线粒体呼吸链复合体I、III活性、线粒体形态及足突改变,增加线粒体DNA含量及ATP含量,降低血糖、体重、血肌酐、尿微量白蛋白/尿肌酐比值水平,提高血白蛋白水平,减轻肾小球肥大、系膜基质增多、胶原蛋白的沉积和肾小管间质纤维化。