本文围绕芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)主要开展了两部分研究工作,第一部分研究了中药单体薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)的肝毒性及其与AhR/CYP1A的关系,第二部分基于实验室前期发现人参皂苷为AhR的部分激动剂,对人参皂苷Rb1对AhR激动剂毒性的逆转作用及药理机制进行了进一步研究。薯蓣皂苷属于甾体皂苷类物质,具有广泛的生物学活性,含有此类成分的天然药物具有广阔的应用前景,但是目前有关薯蓣皂苷毒理及其机制方面研究较少。本实验从细胞水平上检测薯蓣皂苷对肝脏的毒性,同时对薯蓣皂苷作用于HepG2细胞后CYP1A在mRNA和蛋白水平的变化进行了研究,对CYP1A转录调控子AhR的表达进行了检测,旨在探索薯蓣皂苷的肝毒性及其可能的机制。本实验将0.5~32μM薯蓣皂苷作用于HepG2细胞12 h后,利用CCK-8法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验检测薯蓣皂苷对细胞膜的损伤,采用倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成量;瞬时共转染荧光素酶报告基因技术检测薯蓣皂苷对AhR的直接激活作用;实时荧光定量PCR检测薯蓣皂苷作用于HepG2细胞后CYP1A及其转录调控子AhR mRNA的表达;蛋白免疫印迹法检测CYP1A1的蛋白表达水平。结果显示薯蓣皂苷在4~32μM对HepG2的细胞活力产生显著的抑制作用,且呈一定的量效关系;在此浓度范围内,细胞培养上清液中的LDH含量也显著增加,说明一定浓度的薯蓣皂苷会对HepG2细胞膜造成损伤。薯蓣皂苷在8μM时使得HepG2细胞释放大量活性氧物质,在显微镜下观察到薯蓣皂苷在2~32μM能使HepG2细胞不同程度的减少、变圆,且在32μM时细胞几乎全部死亡。在基因水平上,薯蓣皂苷能够浓度依赖性的增强CYP1A1的转录活动;在mRNA水平上,薯蓣皂苷能够浓度和时间依赖性的诱导CYP1A及其转录调控子AhR表达;在蛋白水平上CYP1A1的表达也随着薯蓣皂苷浓度的增大而升高,但是加入一定浓度的白藜芦醇(Resveratrol,Res)后,其作为AhR的拮抗剂能够下调薯蓣皂苷对CYP1A1蛋白的诱导。以上实验结果表明高浓度薯蓣皂苷具有肝细胞毒作用,这可能与其能激活AhR,诱导CYP1A表达进而产生毒性作用有关,同时也提示Ah R激动剂类天然产物可能在高浓度条件下具有潜在的细胞毒性。为了进一步探讨Ah R激动剂细胞毒性,特别是在心脏毒性上的影响,本文采用阿霉素(Doxorubicin,DOX)这类AhR激动剂进行心脏毒性的研究,试图证明Ah R部分激动剂如人参皂苷是否对其心脏毒性具有干预作用。DOX是一种蒽环类化疗药物,在治疗恶性肿瘤中显示出很好的疗效。然而DOX易引起严重的心脏毒性,使其临床应用受到了极大限制。因此,寻找新的既可以减轻阿霉素心脏毒性,同时又可以维持甚至加强其化疗效果的药物非常重要。阿霉素作为一种多环芳香化合物,研究表明在成年大鼠心室肌细胞及h9c2细胞系中它均能够激活ahr并诱导cyp1a1表达,经过研究进一步证明阿霉素是ahr的配体。因此,推测阿霉素的心脏毒性与其激活ahr有关。本实验室前期研究证明具有心血管保护作用的人参皂苷rb1也是ahr的配体和部分激动剂,因此,推测人参皂苷rb1可以作为ahr的部分激动剂与其他某些ahr完全激动剂(如dox)竞争结合ahr,从而干预dox心脏毒性作用。本实验通过细胞凋亡指标变化验证人参皂苷rb1是否能减轻dox的心脏毒性,以及此过程是否有ahr参与。采用50,100,200,400μm人参皂苷rb1预处理h9c2细胞6h后,再向细胞加入dox共处理24h,利用cck-8法检测人参皂苷rb1对dox作用后h9c2细胞活力的影响,elisa法检测人参皂苷rb1及dox对dna碎片产生的影响,采用荧光显微镜观察hoechst33258染色后细胞核的形态,在酶活性及蛋白水平上检测了凋亡相关基因的表达。采用瞬时共转染荧光素酶报告基因技术检测人参皂苷rb1及dox对ahr和cyp1a1启动子区的相互作用的影响,实时荧光定量pcr和蛋白免疫印迹对ahr和cyp1a的mrna及蛋白表达水平分别进行了检测。结果显示与dox单独处理组相比,rb1与dox共处理能明显增强细胞活力,并随着rb1浓度的增加而增加,rb1可浓度依赖性的提高h9c2细胞活力;不同浓度的rb1均可不同程度的抑制dox引起的dna断裂,且rb1在200μm时作用最明显;在显微镜下观察到200μm的人参皂苷rb1能够使dox作用后h9c2细胞凋亡小体形成减少。在对于凋亡相关分子检测结果显示,与对照组相比,dox单独处理组使得caspase-3/7和caspase-8的酶活性显著升高,200μm人参皂苷rb1预处理后其酶活性显著下调,但dox和rb1作用h9c2细胞后caspase-9酶活性并没有明显改变;在蛋白水平上,与dox单独处理组相比,人参皂苷rb1能够使活化的caspase3、parp蛋白表达显著下调,但rb1对dox作用后cytc、bax及bcl-2的蛋白表达均无调节作用。报告基因结果显示,dox和人参皂苷rb1均能够增强ahr与cyp1a1基因启动子区的相互作用,但dox的作用远大于人参皂苷rb1,且不同浓度的人参皂苷rb1均能不同程度的下调dox的效应。实时定量pcr和蛋白免疫印迹结果显示人参皂苷rb1能够显著下调dox对ahr,cyp1a1,cyp1a2的诱导;为了证明ahr是否直接参与了人参皂苷rb1抑制dox对ahr相关基因的诱导,本实验给予h9c2细胞ahrsirna或ahr的拮抗剂ch-223191,显示其抑制了dox对cyp1a1、cyp1a2及ahrmrna的诱导能力,与对照组相比,人参皂苷rb1下调dox对ahr相关基因诱导的作用也明显减弱,且rb1对dox作用后c-caspase3的蛋白表达不再具有下调作用。以上实验结果表明人参皂苷rb1能够削减dox诱导的心肌损伤和凋亡且rb1抑制dox诱导的凋亡可能与死亡受体通路密切相关,且此过程可能由AhR/CYP1A通路介导。本实验为扩大DOX的临床应用范围提供了新的可能,从新的角度阐述了人参皂苷Rb1的心脏保护作用,同时也为临床上心血管的保护提供了一种新的途径。综上所述,本文以AhR为靶点,以薯蓣皂苷及人参皂苷Rb1为主要研究对象,通过对薯蓣皂苷肝毒性及可能的毒性机制的研究和对人参皂苷Rb1对DOX的心肌保护作用的研究,提示评价某化合物是否是AhR的配体或激动剂,对于深入了解其毒理学特性具有重要作用,同时干预Ah R也是潜在的治疗方法,为研究其他中药有毒成分的毒性机制及配伍减毒方案打开了新的思路。