苏云金芽孢杆菌的cry1Ac31和cry39-like基因鉴定及功能的研究

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本课题对32株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)通过镜检、SDS-PAGE分析、PCR-RLFP、生物杀虫活性测定等方法进行了Bt菌株蛋白和基因型的鉴定,结果表明,32株Bt菌株中,有25株含有cry1Ac基因,表达约130kDa的晶体蛋白,有1株可能含有cry39基因,表达约75kDa的晶体蛋白;另外有4株表达蛋白大小约为130kD和2株表达蛋白大小约为140kDa,其基因型尚不能确定,有待进一步分析。选取其中6株进行生物测定表明,产菱形晶体含有cry1Ac基因的4株(S3299-1、S3136-1、S3225-1、S3276-1)对鳞翅目小菜夜蛾幼虫有很强的杀虫活性,产方形晶体菌株S3060-1对淡色库蚁和白纹伊蚊有很好的毒杀活性。   苏云金芽孢杆菌S3299-1是从中国海南岛吊罗山热带雨林区的土壤样品中分离得到的,通过PCR-RFLP方法鉴定出该菌株含有cry1Ac基因,然后用PCR方法克隆基因完整的ORF序列,测序表明该基因编码区(ORF)为3537 bp,编码1178个氨基酸,其分子量约为130kDa,等电点为5.03,为弱酸性蛋白。序列比较结果表明,该基因与cry1Ac类基因高度同源(同源性达99%),已在GeneBank中登录,登录号为:GU446674,被国际Bt毒素命名委员会命名为cry1Ac31。该基因插入表达载体pQE30Xa实现在大肠杆菌异源表达,SDS-PAGE分析表达cry1Ac31蛋白大小为130kDa,其表达蛋白对小菜蛾的杀虫活性LC50为2.204ng/ml。苏云金芽孢杆菌S3060-1是从中国东北的黑龙江省凉水自然保护区土壤中分离出得到,经PCR方法鉴定出该菌株可能含有新型cry39基因,通过SDS-PAGE分析该菌株产生晶体蛋白大约75kDa,生物测定表明,对淡色库蚊和白纹伊蚊的杀虫活性LC50分别为43.833ng/ml和50.846ng/ml。通过改良的转化子池质粒DNA文库筛选方法,筛选出一个含有该基因的阳性克隆子pBU-X,该克隆子插入片段约15kb,尚未完成测序。
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