牡蛎(Oyster),是一种世界性的贝类,也是我国第一大养殖贝类,广泛分布于辽宁、河北、山东、江苏、浙江、广东、广西、海南等地。牡蛎肉中含有丰富的优质蛋白质,是一种高蛋白低脂肪的优良食品。且还有防治心血管病及抗凝血、降血脂、抗血栓、提高机体免疫等功能。牡蛎养殖业在我国农业经济中具有重要的意义。但是在牡蛎养殖过程中极易发生病害,这将影响我国牡蛎养殖业的发展。牡蛎溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应因子,参与机体多种免疫反应,在溶菌过程中形成了一个水解体系,破坏和消除侵入体内的病原,从而实现机体的免疫防御,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的作用,以及具有止血、消肿、防腐和加快组织修复等功能。溶菌酶广泛存在于动植物和微生物中,是一种天然的抗菌剂,能催化N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, NAG)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid, NAM)之间的p-1,4糖苷键的水解,导致细菌细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌死亡。溶菌酶对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有很好的抑菌作用,对人和动物的细胞则不发生溶菌作用,被WHO和许多国家认定为无毒、无害、安全的添加剂,被越来越广泛地应用于医药、食品、生物技术及动物生产等领域。水产动物溶菌酶按其来源分为三类：i型溶菌酶、c型溶菌酶和g型溶菌酶,太平洋牡蛎溶菌酶属于i型溶菌酶。若以牡蛎作为提取牡蛎溶菌酶的原材料,必定牡蛎供应不足且溶菌酶产量低,无法实现工业化生产,而采取DNA重组技术,从原核表达系统中生产牡蛎溶菌酶是解决其供需矛盾的有效途径。本研究以太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)为材料提取总RNA,经RT-PCR扩增太平洋牡蛎溶菌酶基因(称为CgLys基因)的开放阅读框cDNA序列,生物信息软件分析表明,其完整的阅读框全长为414 bp,编码137个氨基酸aa,前20个aa为信号肽,成熟肽由117个aa组成,其分子量为13.2 kDa。通过构建分子系统发育树对其同源性进行分析比较,初步推断该CgLys属于i型溶菌酶。将成熟肽克隆至pMD18-T载体中,经过筛选鉴定后,将重组质粒pMD18T-CgLys进行序列测定。然后将测序正确的基因序列用限制性内切酶BamU I和Sal I双酶切,酶切后的目的基因与通过同样双酶切的表达载体pET-32a(+)连接,从而构建重组质粒pET32a(+)-CgLys并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达和亲和纯化,得到纯化的重组蛋白CgLys。结果表明,通过SDS-PAGE检测原核表达产物,在18 kDa左右获得了明显的目的条带,且该重组CgLys蛋白主要存在于细菌裂解液的上清液中,即以可溶性蛋白形式存在。上述结果将显著简化后续蛋白纯化过程和难度,为今后扩大规模生产牡蛎溶菌酶奠定了应用基础。