斑马鱼作为一种脊椎动物,其器官发育与小鼠和人极为相近,已经作为一种新型模式动物得到广泛的应用。本论文的第一部分工作,主要是利用Tol2转座子在斑马鱼中筛选与肝脏、胰腺、肾脏等内脏器官发育相关的基因。先前的研究已证明,利用Tol2转座子系统可以有效地将Tol2元件插入整合到斑马鱼基因组中。通过显微注射Tol2载体(整合gata2基本启动子及报告基因)和体外转录的转座酶mRNA,使Tol2转座子随机插入到斑马鱼基因组中,当插入位点在某基因附近时,gata2基本启动子受到诱捕到的该基因增强子激活,报告基因受增强子调控并且其表达可以模拟该基因表达的图案。从2004年至今,本实验室利用上述方法在斑马鱼中进行了大规模的“增强子诱捕”筛选,获得了在不同组织和器官特异表达绿色或红色荧光蛋白(GFP/RFP)的转基因斑马鱼系1,784个。这些转基因鱼系的荧光蛋白表达图案包括了各种组织器官如脑、脊髓、感觉器官、神经嵴细胞、脊索、血液、血管、肠、胰腺、肝脏、肾脏、皮肤和生殖细胞。本实验室进一步利用接头介导的PCR方法(LM-PCR,Linker Mediate-PCR),对146个在不同组织特异表达荧光蛋白的鱼系的插入位点进行了分析,其中108个插入可以定位至已知斑马鱼基因组的单一位点。利用胚胎整体原位杂交,通过验证转基因鱼系的GFP表达图案与插入位点附近基因mRNA内源表达图案的一致性,可确切判断诱捕到的基因。分析显示,转基因鱼系的GFP蛋白可以忠实地反映其诱捕到的基因的表达图案。另外,许多在不同组织有特异表达图案的未知基因也在此筛选中发现。我参与了上述工作,并将研究重点放在内脏器官发育基因的研究上,筛选并鉴定到了包括肝脏、胰腺、肾脏等在内脏器官中特异表达GFP的转基因鱼系70个。进一步克隆并鉴定与这些转基因鱼系表达一致的内脏发育相关基因,最终确认早期器官发育中存在特异表达的基因共26个。这些鱼系标记了相应器官系统的各个发育阶段,对研究原基决定、细胞系的分化和增殖具有很重要的意义,同时其对应的基因也可能出现在该器官发育的调控通路之中,为器官发育和疾病机制的研究提供了重要的线索。　　 在以上工作的基础上,我对部分筛选到的内脏器官特异表达GFP的转基因鱼系以及其相应基因的功能进行了深入研究。Mp255c鱼系所诱捕到的mmp23b(matrix metalloproteinases23b)基因是基质金属蛋白酶家族成员,通过对该转基因鱼系Tol2转座子插入在基因组的定位以及运用生物信息学的方法,确定该Tol2插入位点。经过多物种间蛋白序列比对发现该基因与人及小鼠等物种的MMP23B高度同源。基质金属蛋白酶(MMP)家族的成员能够降解细胞外基质的成分以及加工消化多种细胞因子和生长因子,调节正常生理和病理条件下细胞外基质动态平衡。在这里,我们报道了斑马鱼mmp23b基因在肝脏发育中至关重要的作用。Mmp23b基因表达分析结果显示,其mRNA表达水平也具有肝脏特异性。Morpholino(MO)敲低mmp23b将特异引起肝细胞增殖的破坏,进而造成肝脏体积减小,而同时胰腺和肠道的发育则维持正常。遗传学上来讲,mmp23b通过肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路来行使其对肝脏的作用。反义MO敲低斑马鱼中的tnfa或tnfb会引起相似的肝脏体积减小的表型,同时强制过量表达外源tnfa或tnfb能够拯救敲低mmp23b而引起的肝脏减小表型,而相反的实验却无法实现。生化水平上,人类同源的MMP23B能够在一个细胞培养体系中直接与TNF相互作用并调节其从细胞膜上的释放。初步的病理学实验证明mmp23b的缺失可能引发潜在的肝脏脂肪化/纤维化症状。由于mmp23b/MMP23B的高度保守性,这些在斑马鱼里的发现将十分有助于研究该基因在调节哺乳动物肝脏发育以及肝脏病理中的作用。