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目的:
血管钙化是指钙磷酸盐在血管壁上的过量沉积,钙化的增加在心血管系统相关疾病中提示预后不良。可导致动脉弹性丧失的血管中膜钙化和血管平滑肌细胞(VSMCs)有关。细胞外钙感应受体(CaR)在动脉粥样硬化和血管平滑肌细胞钙化中发挥重要的调控作用；细胞外钙感应受体表达降低可引发血管平滑肌细胞钙化。我们的前期研究表明,氯化镧(LaCl3)抑制β-甘油磷酸钠诱导的大鼠VSMCs向成骨样细胞的分化。该作用与对百日咳毒素敏感的G蛋白激活的ERK和JNK信号通路有关。百日咳毒素敏感的G蛋白为CaR的母系家族,因此,明确氯化镧是否通过CaR而对VSMCs钙化起调控作用是值得进一步研究的。并且,研究氯化镧以CaR为靶点对血管钙化的体内调控作用是必要的。
方法:
在细胞实验中,以血管平滑肌细胞为模型,钙沉积和碱性磷酸酶(ALP)活性为检测指标,并采用von Kossa染色法和茜素红染色法观察钙化结节,检测氯化镧在含有1.2 mM钙的培养基或含有1.8 mM钙的培养基中对牛VSMCs钙化的影响。采用纳米粒度仪检测各浓度LaCl3在VSMCs细胞培养基中的粒度分布。用不同浓度的LaCl3对牛VSMCs诱导12天后,应用MTT实验检测对细胞活力的影响,应用扫描电镜检测固相的形成,用流式细胞仪检测细胞凋亡,以及用激光共聚焦显微镜测定线粒体膜电位的变化及细胞内钙水平。用Western blot方法检测CaR蛋白表达,并用CaR激动剂及拮抗剂考察CaR对于细胞钙化的影响。
在动物实验中,以apoE-/-小鼠为模型,LaCl3灌胃三个月后,用常规方法测定鼠静脉血中总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。并用苏木素-伊红染色(HE染色)、von Kossa染色、油红O染色、CaR染色测定LaCl3对apoE基因敲除小鼠斑块及动脉钙化的影响。
结果:
1.氯化镧对牛VSMCs呈现浓度依赖的双向调节作用:50μM LaCl3预处理显著升高细胞钙沉积量,而0.10μM LaCl3预处理可抑制钙沉积。
2.50～200μM LaCl3在VSMCs细胞培养基中诱导形成粒径在200～400 nm的钙磷酸盐纳米微粒。
3.0.10～10μM LaCl3预处理对牛VSMCs活力无影响,而50～200μM LaCl3预处理可降低牛VSMCs的活力。
4.50～200μM LaCl3预处理降低牛VSMCs线粒体膜电位,促进细胞凋亡；50μMLaCl3引起细胞内钙水平的升高。
5.0.10μM及50μM LaCl3均上调CaR的表达。CaR的激动剂AMG073对β-甘油磷酸钠处理12天的牛VSMCs起抑制钙化作用且增强了由0.10μM LaCl3引起的抑制钙化作用,但对50μM LaCl3的促进钙化作用无影响。CaR的拮抗剂NPS2143对β-甘油磷酸钠处理12天的牛VSMCs的钙化无影响但削弱0.10μMLaCl3引起的抑制钙化效应,并增强了由50μM LaCl3引起的促进钙化作用。
6.氯化镧对apoE基因敲除小鼠血清TC、LDL-C、TG、HDL-C及AI水平有显著影响,并能成剂量依赖性地降低粥样硬化斑块形成,上调CaR的表达,对斑块钙沉积有抑制作用。
结论:
1.氯化镧对牛VSMCs呈现浓度依赖的双向调节作用:低浓度通过激活CaR抑制钙化的形成；高浓度通过形成钙磷酸盐纳米微粒引起VSMCs凋亡而促进钙化。
2.氯化镧降低apoE基因敲除小鼠粥样硬化斑块的形成,上调CaR的表达,对斑块钙沉积的形成有抑制作用。