血小板主要用于预防和治疗血小板减少及其功能障碍引起的出血和出血倾向,在临床发挥着不可替代的作用。血小板主要来源于无偿献血者,尽管按照国家规定对其进行检测,但仍存在残余风险。其一,多种病原体可经血液传播,除了目前已知的经血液传播的病原体如HIV、HBV、HCV、TP等外,还有一些新出现及未知的病原微生物,而检测项目有限。其二,由于检测技术的局限性和“窗口期”的存在等,导致漏检。如何进一步提高异体血小板安全性是人们关注的热点问题,血小板病原体灭活技术的研究正是为提高异体血小板安全性而生。本实验室前期设计了一台UVC(短波紫外线)灭活装置,研究发现UVC照射处理可有效灭活血小板悬液中的伪狂犬病毒和辛德毕斯病毒,但是筛选辐照剂量时跨度较大,也未对UVC处理后血小板的质量做出评估。因此,本研究中,我们着重于辐照剂量的重新筛选以及筛选出的辐照剂量处理血小板对其质量的影响,探索在达到灭活效果的同时尽量确保血小板的质量,具体研究内容如下。一、绘制灭活曲线,选取适宜的短波紫外线辐照剂量我们以PRV(伪狂犬病毒,HBV指示病毒)、SNV(辛德毕斯病毒,HCV指示病毒)作为指示病毒,将病毒悬液加入血小板悬液中,两者的体积比为1:9,经一系列辐照剂量处理后,微量细胞病变法检测病毒滴度,绘制灭活曲线。实验观察到UVC辐照剂量为0.22J/Cm2,PRV减少滴度(4.33±0.28)logs,SNV减少滴度(4.75±0.25)logs,达到了《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的要求(病毒降低量log10>4 logs)。因此我们选取的UVC辐照剂量为 0.22J/cm2,所得结果与 THERAFLEX UV-Platelets system(Macopharma)相近。二、选取适宜辐照剂量处理血小板,评估灭活后血小板质量的变化血小板经0.22J/cm2辐照剂量处理,扫描电镜观察到UVC照射处理后的血小板外形极不规则,伪足伸出,这是血小板处于激活状态的表现。同时,实验观察到UVC照射处理导致血小板计数下降,体积增大(MPV、P-LCR增加),血小板激活标志PAC-1、CD62p和凋亡标志Annexin V阳性表达率均升高,HSR下降,ROS生成增加,差异均有统计学意义(ROS第五天差异有统计学意义),UVC照射处理对血小板质量有一定的影响。三、UVC处理血小板悬液过程中保护剂的初步筛选UVC照射处理导致血小板活化、ROS生成增加。因此我们选择添加血小板活化抑制剂维生素B6、L-Arg和抗氧化剂GSH、NAC、组氨酸,观察这些试剂是否能减少短波紫外线对血小板的损伤。结果发现添加300μm L-Arg第三天MPV下降,第五天血小板HSR上升,差异均有统计学意义;分别添加0.25mM维生素B6、1mMNAC和1mM组氨酸对血小板血块收缩、血小板计数、MPV、P-LCR、HSR均无明显保护作用,亦无明显损害作用。根据实验结果我们初步筛选出300μm L-Arg作为保护剂,但是因实验标本量较少,实验中用来筛选保护剂的检测指标不多,因此我们还选择了 0.25mM维生素B6、1mMNAC和1mM组氨酸,以进一步研究其是否能有效保护经UVC处理的血小板的质量。四、初筛出的保护剂对短波紫外线灭活血小板悬液中PRV、SNV效果的影响血小板悬液中加入PRV或者SNV,再加入初步筛选出的保护剂,然后经辐照剂量为0.22J/cm2的UVC照射处理,微量细胞病变法检测病毒滴度。结果发现0.25mM维生素B6、3000μmL-Arg、1mMNAC、1mM组氨酸均不影响UVC灭活血小板悬液中的PRV、SNV的效果。综上所述,本研究发现短波紫外线在辐照剂量为0.22J/Cm2时可有效灭活血小板悬液中的伪狂犬病毒、辛德毕斯病毒;UVC照射处理对血小板质量有一定的影响;初步筛选短波紫外线处理血小板悬液过程中的保护剂;初筛出的试剂对UVC灭活血小板悬液中的PRV、SNV的效果无明显影响。我们还需更多实验进一步证实以上初筛出的试剂是否能有效保护经UVC处理的血小板的质量,以及探索如何在保证病原体灭活效果的同时尽量确保血小板的质量。