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蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种常见的脑血管疾病,其发病率约占脑卒中的5-10%,具有高死亡率、高致残率的流行病学特点。早期脑损伤(early brain injury,EBI)是一系列发生于发病72小时内,以脑血流减少、脑水肿、细胞凋亡、炎症等为主要特点的病理生理变化;是SAH导致患者急性期死亡和长期神经功能障碍的重要原因。因此,抑制早期神经元凋亡、血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏有助于改善SAH的预后。HLY78是一种小分子的菲啶类生物碱化合物,由石蒜碱改造而来。在体外研究中,HLY78通过作用于Axin的DIX结构域,可促进Axin与低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low-density lipoprotein receptor-related protein 6,LRP6)结合,从而使LRP6磷酸化激活下游经典的Wnt信号通路。Wnt通路已经被证实参与了脑卒中神经元凋亡的调控,并在血脑屏障的形成与维持等过程中起着重要的作用。然而,目前尚无关于HLY78在SAH动物模型中的研究。本研究通过行为学和组织学等实验方法,探讨了HLY78对SAH大鼠的神经保护作用及潜在的分子机制,为减轻SAH导致的神经元凋亡和血脑屏障破坏提供了新的研究方向。第一部分HLY78对蛛网膜下腔出血后神经功能的影响目的研究HLY78对SAH导致的短期和长期神经功能障碍的疗效以及HLY78的生物安全性。方法采用Sprague-Dawley大鼠(280-310 g)构建SAH动物模型。大鼠被随机地分为假手术组(sham)、安慰剂组(SAH+vehicle)和HLY78治疗组(SAH+HLY78)。为了探索最适宜的给药剂量,HLY78治疗组又根据剂量不同被分为三个亚组:SAH+HLY78(0.2 mg/kg)、SAH+HLY78(0.6 mg/kg)、SAH+HLY78(1.8 mg/kg)。根据建立SAH模型24小时后大鼠神经功能学评分结果确定最适的给药浓度。并通过Foot-fault、Rotarod、Morris水迷宫、Fluoro-Jade C染色等实验,分析HLY78对SAH导致的长期的运动障碍、认知功能障碍和神经元退行性变的影响。最后给予健康大鼠生理盐水和HLY78(0.6 mg/kg)干预,建立Na?ve+vehicle组和Na?ve+HLY78组,通过进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE staining)、测量大鼠体重变化,评估HLY78治疗对机体毒性作用。结果1.HLY78能显著地改善SAH后大鼠短期的神经功能障碍。与sham组相比,SAH+vehicle组在诱导SAH 24小时后可观察到神经功能评分显著地下降(p<0.01);HLY78(剂量为0.6 mg/kg和1.8 mg/kg)能明显地改善大鼠SAH后24小时的神经功能评分(p<0.05);而HLY78的剂量为0.2 mg/kg时,对SAH大鼠的神经功能对无显著的影响(p>0.05)。2.HLY78治疗能明显地减轻SAH大鼠的长期神经功能障碍:与SAH+vehicle组比较,在第7、14天的Foot-fault实验中,SAH+HLY78组大鼠肢体在金属网格板上踏空的次数明显下降(p<0.05);在Rotarod实验中,当滚轴转速为5rpm和10rpm时,SAH+HLY78组大鼠在滚轴上停留的时间都显著地延长(p<0.05);在Morris水迷宫实验中,SAH+HLY78组大鼠找到平台前逃避潜伏期(escape latency)和游泳距离(swim distance)均显著地缩短(p<0.05),并且在平台所在区域探索的时间明显更长(p<0.05)。另外Fluoro-Jade C染色发现HLY78能显著地减少大脑退化神经元的数量(p<0.05)。3.HLY78在动物体内应用的安全性:Na?ve+vehicle(normal saline,NS)和Na?ve+HLY78组动物在给药后第1、7、14、21天的体重无明显地统计学差异。HE染色结果均未观察到肝、肾的正常组织细胞坏死。结论本研究发现HLY78能显著地改善SAH后短期和长期的神经功能障碍,且该研究中应用的治疗剂量对机体无明显的毒性作用。第二部分HLY78对蛛网膜下腔出血后神经元凋亡的影响及其潜在机制目的1.研究p-LRP6、LRP6在SAH后大脑皮层组织中的表达情况。2.探索HLY78对SAH导致的神经元凋亡的影响。3.利用特异性LRP6小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)探索HLY78对SAH后神经元凋亡的抑制作用及其潜在的机制。方法1.采用左侧颈内动脉血管内穿刺法建立SAH大鼠模型,通过蛋白印迹(Western blot,WB)和免疫荧光技术检测诱导SAH后0、6、12、24和72小时内源性p-LRP6、LRP6在左侧大脑皮层中的表达情况。2.建立SAH模型后1小时经鼻腔给予HLY78治疗,采用Western blot、转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(Transferase-mediated deoxy uridine triphosphate-biotin nick end labeling,TUNEL)、免疫荧光等检测HLY78治疗后神经元的凋亡。3.在建立SAH模型前24小时,经右侧脑室微量泵入LRP6 siRNA。给予siRNA后对大鼠的神经功能再次进行评分。通过Western blot等技术检测p-LRP6、LRP6、GSK3β、β-catenin以及cleaved casepase 3、Bax、Bcl-2等蛋白的水平。结果1.Western blot结果显示内源性p-LRP6在SAH后6至72小时内表达明显增加(p<0.01),24小时达到最高峰。免疫荧光结果显示p-LRP6在神经元、星形胶质细胞上均有表达。2.Western blot结果显示与SAH+vehicle组相比,HLY78治疗组Bcl-2表达显著地增加,而cleaved casepase 3和Bax表达下降(p<0.01)。TUNEL染色结果显示SAH+vehicle组TUNEL阳性的神经元较sham组明显增多(p<0.01);HLY78可显著地减少TUNEL阳性神经元的数量(p<0.01)。3.在机制研究中发现与SAH+HLY78+scrambled siRNA比较,右侧脑室注射LRP6 siRNA后大鼠神经功能评分明显下降(p<0.05)。而Western blot分析结果显示,与SAH+vehicle组相比,HLY78治疗组p-LRP6、p-GSK-3β、β-catenin、Bcl-2的表达水平升高(p<0.05),同时p-β-catenin、Bax、cleaved casepase 3表达水平下降(p<0.01)。LRP6 siRNA敲低LRP6的表达后p-LRP6、p-GSK-3β、β-catenin、Bcl-2表达下降,而p-β-catenin、Bax、cleaved casepase 3表达水平增加(p<0.05)。结论该部分研究发现HLY78可抑制SAH导致的神经元凋亡,而LRP6介导的Wnt/β-catenin信号通路参与了HLY78抗凋亡作用的调节。该研究为治疗SAH诱导的神经元凋亡提供了新的方向。第三部分HLY78对蛛网膜下腔出血后血脑屏障的影响及其潜在机制目的1.研究HLY78对SAH导致的血脑屏障破坏的影响。2.利用特异性LRP6 siRNA研究HLY78对SAH发生后血脑屏障的保护作用及潜在的机制。方法1.利用大鼠建立SAH模型,通过Western blot技术检测SAH后0、6、12、24、72小时内源性p-LRP6、LRP6在左侧脑组织中的表达水平;利用免疫荧光检测p-LRP6是否在血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)上表达。2.建立SAH模型后1小时经鼻腔给予HLY78。SAH发生24小时后取材,采用干湿重法定量分析大鼠脑组织的含水量。通过腹腔注射伊文思兰溶液(Evans blue,EB),取材定量分析Evans blue渗出,评估血脑屏障完整性。3.在建立SAH模型前24小时经右侧脑室微量泵入LRP6 siRNA。评估给予siRNA后神经功能评分。通过Western blot等技术检测p-LRP6、LRP6、β-catenin、Occludin、ZO-1和Claudin-5等蛋白的表达水平。结果1.Western blot结果显示内源性p-LRP6在SAH发生后6至72小时内明显上调(p<0.01),在24小时达到最高峰。免疫荧光显示p-LRP6与血管内皮细胞共表达,与sham组相比,SAH组p-LRP6在血管内皮细胞上表达增多。2.脑组织含水量和Evans blue渗出检测结果显示:与SAH+vehicle组相比,HLY78治疗组的脑组织含水量明显下降(p<0.01);另外与SAH+vehicle组比较,HLY78治疗组的脑组织Evans blue渗出也明显减少(p<0.01)。3.从右侧脑室注射LRP6 siRNA后,再次进行神经功能评分显示:SAH+HLY78+siRNA组的大鼠神经功能评分较SAH+HLY78+scrambled siRNA组明显下降(p<0.01)。Western blot结果显示,与SAH+vehicle组相比,HLY78治疗组p-LRP6、β-catenin、Occludin、ZO-1、Claudin-5的表达上调(p<0.01)。LRP6 siRNA可导致p-LRP6、β-catenin、Occludin、ZO-1、Claudin-5表达水平显著地下降(p<0.01)。结论该研究表明HLY78可通过调控Wnt/β-catenin信号通路,减轻SAH导致的血脑屏障破坏,改善神经功能障碍。该研究为治疗SAH导致的血脑屏障破坏提供了新的靶点。