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目的：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）能侵入胃上皮细胞，并在细胞中生存，以逃避抗生素的杀灭并引起二次感染，从而导致临床治疗失败。因而，明确Hp侵入胃上皮细胞的机制对彻底根治Hp感染有重要的意义。已知β1-integrin与Hp黏附侵入胃上皮细胞密切相关，但与其相互作用的细菌蛋白尚不十分明确。本课题组前期已证明Hp的毒力蛋白CagA和CagL在Hp黏附侵入胃上皮细胞中起到重要作用。鉴于CagL是介导CagA侵入细胞的蛋白，目前尚不清楚CagL对Hp侵袭功能的影响是通过 CagA引起抑或是其自身具有的侵袭功能引起；CagL可与β1-integrin和β5-integrin结合，细胞的β5-integrin是否参与了Hp的侵袭尚不清楚。为此，本研究将主要围绕这两个问题开展研究，以阐明CagL及β5-integrin在Hp侵袭功能中的作用。 方法： 1.鉴定β5-integrin在Hp侵入AGS细胞的作用 将AGS细胞种于24孔板，分别用0μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml四个不同浓度的Antiβ5-integrin预处理，45min后每孔加入Hp NCTC11637（MOI=100），3小时后，加入终浓度为200μg/ml的庆大霉素，以杀灭黏附于AGS细胞表面的Hp，用0.1%皂角苷裂解液裂解细胞，使侵入AGS细胞中的Hp释放，将裂解液涂布于哥伦比亚血平板，经5-6天培养后，计数菌落，所得数为Hp侵入AGS细胞的细菌数。 2.β1-integrin和β5-integrin共同介导Hp侵入AGS细胞 2.1 应用CRISPR/Cas9方法构建AGS-β1-integrinKO稳定细胞株 将AGS细胞共转染Integrinβ1 CRISPR/Cas9KO(knockout)和Integrinβ1 HDR（homology-directed repair）质粒，培养36h后加入终浓度为0.5μg/ml的Puromycin筛选阳性转染细胞，提取该细胞蛋白以及基因组，进行Western blot和测序鉴定，阳性株命名为AGS-β1-integrinKO。 2.2 NCTC11637对Antiβ5-integrin预处理的AGS-β1-integrinKO的侵入作用 将AGS细胞和AGS-β1-integrinKO种于24孔板，分为四组：AGS组、AGS+Antiβ5-integrin组、AGS-β1-integrinKO组、AGS-β1-integrinKO+Antiβ5-integrin组，培养14-16h后，抗体组加入终浓度为1μg/ml的Antiβ5-integrin处理，45min后每孔加入NCTC11637（MOI=100），余处理同1。 2.3 NCTC11637对Antiβ1-integrin和Antiβ5-integrin预处理AGS细胞的侵入作用 将AGS细胞种于24孔板，分为4组：AGS组、AGS-Antiβ1-integrin组、AGS-Antiβ5-integrin组、AGS-Antiβ1-integrin+Antiβ5-integrin组，培养14-16h后，各组加入终浓度为1μg/ml的相对应的抗体预处理45min，每孔加入NCTC11637（MOI=100），余步骤同1。 3.β1-integrin和β5-integrin在黏附AGS细胞中的作用 分组处理同2.3，45min后，每孔加入NCTC11637（MOI=100），3h后，用无菌PBS洗涤，去除未黏附的Hp，0.1%皂角苷裂解液裂解，涂布于哥伦比亚血平板上，经5-6天培养后，计数细菌菌落数，将所得菌数减去步骤2.3中侵入细胞的菌数，得到黏附细胞的细菌数。 4.鉴定CagL的侵袭功能 将AGS细胞种于24孔板，分为6组，培养14-16h后，弃去细胞培养基，加入无FBS培养基继续培养1h，向其中3组加入终浓度为1μg/ml的RGD预处理（以封闭β1-integrin与CagL的结合位点），另3组不做处理，45min后向细胞中分别加入MOI=100的NCTC11637、NCTC11637/ΔcagA和NCTC11637/ΔcagL，余步骤同1。 5.统计学方法 数据统计和分析采用SPSS.22进行单样本t检验。 结果： 1.β5-integrin在Hp侵入AGS细胞中的作用 不同浓度的Antiβ5-integrin预处理AGS细胞，比较NCTC11637侵入AGS细胞的细菌数，1μg/ml Antiβ5-integrin组的细菌侵入数显著低于0μg/ml组的侵入数（P＜0.05）。表明NCTC11637对 AGS的侵入作用能被Antiβ5-integrin阻断，β5-integrin为介导Hp侵入AGS细胞的受体。 2.β1-integrin和β5-integrin共同介导Hp侵入AGS细胞 2.1 应用CRISPR/Cas9方法构建AGS-β1-integrinKO细胞株 提取AGS-β1-integrinKO细胞的细胞蛋白和基因组，分别进行Western blot和测序鉴定，Westren blot示AGS-β1-integrinKO稳定细胞不表达β1-integrin；测序结果示AGS-β1-integrinKO中测到的sgRNA(single guide RNA)与构建在integrinβ1 CRISPR/Cas9质粒中的sgRNA序列一致。 2.2 β1-integrin和β5-integrin共同介导Hp侵入AGS细胞 比较AGS组、AGS+ Antiβ5-integrin组、AGS-β1-integrinKO组和AGS-β1-integrinKO+Antiβ5-integrin组NCTC11637侵入细胞的菌数，AGS+Antiβ5-integrin组和AGS-β1-integrinKO组的细菌侵入数均显著小于AGS组（均为P＜0.05），AGS+Antiβ5-integrin组和AGS-β1-integrinKO组的细菌侵入数无显著差异，AGS-β1-integrinKO+Antiβ5-inte grin组的侵入数显著小于AGS+Antiβ5-integrin组和AGS-β1-integrinKO组（均为P＜0.05），表明β5-integrin和β1-integrin共同介导Hp侵入AGS细胞。 比较AGS组、AGS-Antiβ1-integrin组、AGS-Antiβ5-integrin组和AGS-Antiβ1-integrin+Antiβ5-integrin组NCTC11637侵入细胞的菌数，AGS-Antiβ5-integrin组和AGS-Antiβ1-integrin组的侵入数均显著小于AGS组（均为P＜0.05），AGS-Antiβ5-integrin组和AGS-Antiβ1-integrin组之间无显著差异，AGS-Antiβ1-integrin+Antiβ5-integrin组的侵入数显著小于AGS-Antiβ5-integrin组和AGS-Antiβ1-integrin组（均为P＜0.05），同样表明，β5-integrin和β1-integrin共同介导Hp侵入AGS细胞。 3.β1-integrin和β5-integrin在黏附AGS细胞中的作用 比较AGS组、AGS-Antiβ1-integrin组、AGS-Antiβ5-integrin组和AGS-Antiβ1-integrin+Antiβ5-integrin组NCTC11637粘附细胞的菌数，AGS-Antiβ5-integrin组和AGS-Antiβ1-integrin组的黏附数均显著小于AGS组（均为P＜0.05），AGS-Antiβ5-integrin组和AGS-Antiβ1-integrin组之间无显著差异，差异性与侵袭结果相似，提示β5-integrin和β1-integrin介导的Hp侵袭作用均与黏附相关。 4.CagL的侵袭功能 NCTC11637、NCTC11637/ΔcagA、NCTC11637/ΔcagL分别感染AGS细胞和RGD预处理（以封闭β1-integrin与CagL的结合位点）的AGS细胞，计算每组Hp的侵入数，NCTC11637组的侵入数显著高于NCTC11637+RGD组（P＜0.05），表明 RGD可通过封闭β1-integrin与CagL的结合位点，影响Hp的侵袭能力；NCTC11637/ΔcagA+RGD组的侵入数显著低于NCTC11637/ΔcagA组（P＜0.05），表明在CagA不存在的情况下，CagL仍能在Hp侵袭作用中起作用，且CagL可通过β1-integrin介导侵袭；NCTC11637/ΔcagA+RGD组的侵入数显著低于NCTC11637+RGD组（P＜0.05），表明CagA在没有CagL介导入细胞的情况下，仍能在 Hp侵袭作用中起作用；NCTC11637+RGD组的侵入数高于NCTC11637/ΔcagL组（P＜0.05），进一步表明介导Hp侵袭AGS细胞的受体不仅仅只有β1-integrin。 结论： 1.β5-integrin是幽门螺杆菌侵入胃上皮细胞的受体。 2.β5-integrin和β1-integrin共同介导幽门螺杆菌侵入胃上皮细胞，该介导作用与细菌的粘附相关。 3.CagL能不依赖CagA介导细菌侵入胃上皮细胞。