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HERG钾通道电流是心肌细胞动作电位的重要组分,在3期复极化晚期发挥关键作用。药物的阻断作用或HERG基因突变造成该电流减少,可分别导致获得性LQTS和遗传性LQTS (LQT2)。就LQT2而言,目前已发现的突变位点有200多个,但致病机制各不相同。A422T和H562P是从两个不同家庭LQTS病人筛选到的错义突变位点,电生理分析结果显示,这两种不同位点突变通道电流明显减小,功能缺失,但具体的发生机制是何,尚不清楚。本课题利用膜片钳技术结合细胞分子生物学技术,研究分析A422T和H562P突变导致HERG钾通道功能缺失的机制,并探讨不同方法的挽救效果,为理解通道蛋白运输缺陷导致HERG钾通道功能缺失、造成LQT2的细胞分子机制提供详实的实验依据,同时为LQTS疾病的临床治疗提供新视点。主要结果如下：1.首先,利用全细胞膜片钳技术,对分别表达A422T和H562P突变通道的HEK 293细胞进行检测,结果发现两种错义突变均可导致HERG钾通道电流幅度减少,电压依赖性消失,说明A422T和H562P存在不同程度的功能缺失。Western blot实验结果显示,A422T和H562P通道的155 kDa成熟蛋白组分消失,提示突变蛋白存在转运障碍。这一结果进一步在免疫细胞化学检测实验得到证实,表现在A422T与H562P突变通道蛋白膜分布减少,胞质内蛋白增加,且与内质网共定位,说明两种突变通道蛋白由于转运障碍而被滞留在内质网内。2.其次,将WT与A422T或H562P的质粒共转HEK 293细胞,利用全细胞膜片钳技术及western blot检测的结果显示,杂合型通道的电流及成熟蛋白表达均显著少于WT,并且随着转染突变体质粒量的增加,通道功能和蛋白表达受损加重,说明A422T、H562P对WT的电流及蛋白表达有浓度依赖的负显性抑制作用。进一步对A422T/WT(转染时质粒的量为1：1,模拟病人常见杂合基因型)、H562P/WT(转染时质粒的量为1：1,模拟病人常见杂合基因型)的电生理特性进行检测分析,其结果表明,除成熟蛋白表达减少外,杂合型通道的动力学与WT相比也有改变,A422T/WT主要表现在激活过程减慢,而H562P/WT表现在失活过程加快。而与A422T/WT相比,H562P/WT具有更快激活,更快失活的特点,这将使通道得开放时间缩短,进而显著影响动作电位复极化的钾离子流。这种动力学的改变是导致杂合型通道功能缺陷的另一原因。3.进一步利用不同方法对A422T、H562P突变通道进行处理,比较其对电流及蛋白表达的挽救作用,分析两突变体的结构及转运障碍的分子机制。在低温或E4031处理条件下,A422T突变通道的功能和蛋白转运均可得到显著改善,不但再次证明A422T突变通道蛋白转运障碍发生于内质网,并且说明该突变通道蛋白可形成基本的四聚体结构及孔道结构,系一种错误折叠不严重的突变蛋白；相反,两种处理对H562P突变通道却无效,说明其蛋白折叠错误严重,无法被常用方法挽救。在过表达Hsp70和/或Hsp90的情况下,Co-IP检测证实A422T或H562P与Hsp70和Hsp90三者之间存在相互作用,并且与野生型HERG钾通道蛋白相比,突变通道蛋白与Hsp70或Hsp90的结合量也不同；过表达Hsp70和Hsp90对A422T突变通道电流有部分挽救作用,而对蛋白表达没有显著影响；这种挽救作用存在于单独过表达Hsp90而不是Hsp70的条件下,雷公藤红素——Hsp90的抑制剂可取消其挽救作用。这些说明Hsp70、Hsp90均参与HERG钾通道蛋白的转运过程,但Hsp90对A422T的蛋白转运更为重要。对H562P突变通道而言,尽管与Hsp70和Hsp90存在相互作用,但无论过表达Hsp70和/或Hsp90,对其功能和蛋白表达都无明显影响,进一步说明两种不同位置的错义突变,影响其功能的机制存在差异。H562P突变无法被内质网质量控制系统纠正。在适度低氧刺激(2%O2作用24hr)下,对WT通道电流及蛋白成熟过程均有明显促进作用,也可使A422T突变通道功能部分恢复,但对H562P无影响。提示适当的内质网应激(ER stress)可以促进HERG钾通道蛋白的转运、成熟。4.最后,利用反转录PCR实验技术检测XBP1的剪切情况,了解两突变体是否在细胞内过度堆积,引起ER stress。实验结果表明A422T和H562P突变通道蛋白虽然阻滞于内质网中,但并未过多堆积,也未造成ER stress,而是及时进入泛素-蛋白酶体途径进行降解。结论：1.HERG错义突变A422T和H562P使通道蛋白转运障碍并阻滞于内质网,是导致通道功能缺失并引起LQTS (LQT2)的细胞分子机制；2.A422T突变体是错误折叠不严重的蛋白,可形成四聚体结构,在低温、药物、分子伴侣或低氧处理后可恢复部分功能；3.H562P突变体,尚没有有效的方法挽救其功能。可能是由于H562P位于S5跨膜片段,位于孔道内部,位置关键且隐蔽,难以纠正。