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目的:通过建立小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)氧糖剥夺/再复氧(OGD/R)模型,探讨24-乙酰泽泻醇A对OGD/R损伤bEnd.3细胞的保护作用及其与miR-92a-3p的关系。方法:1.24-乙酰泽泻醇A对OGD/R损伤bEnd.3细胞的保护作用研究(1)采用缺氧培养箱建立OGD/R模型,用cck8法检测不同缺氧时间bEnd.3细胞的活性,选择相对活性50%-60%作为造模条件。(2)检测1mg/L、10mg/L和20mg/L的24-乙酰泽泻醇A对OGD/R损伤bEnd.3细胞形态及活性的影响;一氧化氮试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒分别检测NO和LDH;ELISA试剂盒检测24-乙酰泽泻醇A对TNF-α和IL-1β的影响;western bolt检测紧密连接蛋白(claudin-5、occludin、ZO-1)的表达,探讨24-乙酰泽泻醇A对OGD/R损伤细胞是否有保护作用。(3)通过qPCR检测24-乙酰泽泻醇A对OGD/R损伤细胞miR-92a-3p和miR-92a-1-5p表达的影响。通过Targetscan7.2和miRDB数据库寻找miR-92a-3p可能靶基因,进一步探讨24-乙酰泽泻醇A对bEnd.3细胞OGD/R损伤的保护作用及其与miR-92a-3p的相关性。2.miR-92a-3p对OGD/R损伤bEnd.3细胞的调控作用研究转染miR-92a-3p mimics和miR-92a-3p inhibitor,并予OGD/R损伤,cck8法检测miR-92a-3p转染对OGD/R损伤bEnd.3细胞活性的影响;利用试剂盒检测NO、LDH的含量;western bolt检测紧密连接蛋白(claudin-5、occludin、ZO-1)的表达,探讨miR-92a-3p对OGD/R损伤bEnd.3细胞及紧密连接的影响。进一步通过双荧光素酶报告基因方法,验证miR-92a-3p的靶基因。结果:1.24-乙酰泽泻醇A对OGD/R损伤bEnd.3细胞的保护作用(1)造模后,OGD8h/R16h的细胞活性降低(P<0.05),为(57.29±5.87)%,作为后续实验造模条件。(2)1mg/L的24-乙酰泽泻醇A可减轻LDH的释放(P<0.05),抑制TNF-α的表达(P<0.01),上调紧密连接蛋白(claudin-5和ZO-1)的表达(P<0.05),但对细胞活性、NO水平、IL-1β及occludin的表达无明显作用。10mg/L和20mg/L的24-乙酰泽泻醇A可提高细胞活性(P<0.01)和NO含量(P<0.01和P<0.05),减轻LDH的释放(P<0.01),抑制TNF-α和IL-1β的表达(P<0.01),促进紧密连接蛋白(claudin-5和ZO-1)的表达(P<0.05),并且10mg/L的24-乙酰泽泻醇A可逆转OGD/R损伤后occludin的低表达(P<0.05)。(3)OGD/R诱导bEnd.3细胞miR-92a-3p和miR-92a-1-5p的表达上调(P<0.01),10mg/L和20mg/L的24-乙酰泽泻醇A可特异性下调miR-92a-3p的表达(P<0.01),但对于miR-92a-1-5p表达无明显作用。通过Targetscan7.2和miRDB数据库寻找miR-92a-3p的靶基因与紧密连接相关。利用碱基配对原则,发现miR-92a-3p可与occludin和ZO-1的3’UTR序列结合,提示miR-92a-3p可能直接靶向调控occludin和ZO-1表达。2.24-乙酰泽泻醇A通过抑制miR-92a-3p的表达改善bEnd.3细胞OGD/R损伤(1)在OGD/R损伤下,细胞转染mimics NC和inhibitor NC,细胞活性、LDH、NO含量和紧密连接蛋白表达与OGD组相近,差异均无统计学意义,说明转染对bEnd.3细胞OGD/R损伤无副作用。(2)miR-92a-3p mimics(50nmol/L)使bEnd.3细胞miR-92a-3p表达上调,细胞活性和NO含量降低(P<0.05),紧密连接蛋白(claudin-5、occludin和ZO-1)表达下调(P<0.05),说明miR-92a-3p mimics进一步加重bEnd.3细胞损伤;转染miR-92a-3p mimics并予10mg/L 24-乙酰泽泻醇A处理,与单独转染miR-92a-3p mimics的比较,细胞活性、NO和LDH含量、紧密连接蛋白均有明显提高(P<0.01),说明24-乙酰泽泻醇A可减轻miR-92a-3p mimics诱导的细胞损伤。(3)转染miR-92a-3p inhibitor,无论是否添加24-乙酰泽泻醇A预处理,均可明显提高细胞活性(P<0.01)和NO含量(P<0.01),减少LDH溢出(P<0.05),上调claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表达(P<0.01或P<0.05)。miR-92a-3p抑制剂对OGD/R损伤内皮细胞具有保护作用,并与24-乙酰泽泻醇A作用相似。(4)双荧光素酶报告基因实验表明野生型occludin 3’UTR和野生型ZO-1 3’UTR的荧光素酶活性低于对照组(P<0.01),而miR-92a-3p对突变型occludin 3’UTR和突变型ZO-1 3’UTR的荧光素酶活性的影响较小,证实occludin和ZO-1为miR-92a-3p的靶基因,说明24-乙酰泽泻醇A通过抑制miR-92a-3p表达调控occludin和ZO-1的表达,从而发挥OGD/R损伤内皮细胞的保护作用。结论:1.24-乙酰泽泻醇A可明显改善细胞形态,提高细胞活性,促进NO的释放,降低炎症因子(TNF-α、IL-1β)的表达,保护紧密连接蛋白(claudin-5、occludin和ZO-1),减轻bEnd.3细胞OGD/R损伤。2.OGD/R诱导bEnd.3细胞miR-92a-3p高表达,24-乙酰泽泻醇A可特异性抑制miR-92a-3p的表达。3.在OGD/R条件下,miR-92a-3p mimics对bEnd.3细胞造成进一步损伤。miR-92a-3p inhibitor通过提高细胞活性和NO的水平,促进紧密连接蛋白的表达等作用,多靶点、多途径改善内皮细胞的损伤,说明了miR-92a-3p inhibitor对OGD/R损伤内皮细胞的具有保护作用。4.miR-92a-3p靶向调控occludin和ZO-1的表达,进一步说明24-乙酰泽泻醇A通过抑制miR-92a-3p表达作用于occludin和ZO-1,而发挥OGD/R损伤内皮细胞的保护作用。