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α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-Gal,EC 3.2.1.22）能专一性催化半乳低聚糖、多糖、糖脂及糖蛋白中α-1,6-半乳糖苷键的水解,在食品、饲料、医药及轻工业等领域具有广泛的应用,因此近年来对它的研究较多。但是α-Gal存在热稳定性差、催化效率低等问题,同时较低的产量也限制了其应用。构建出热稳定性良好、比酶活高、表达量高的α-Gal基因工程菌具有重要的研究意义。本研究成功地将源于水稻（Oryza sativa L.subsp.japonica var.Nipponbare）的riceα-Gal II基因通过a-凝集素锚定表达于酿酒酵母细胞表面,得到酿酒酵母表面展示（Yeast Surface Display,YSD）的全细胞催化单元YSD riceα-Gal II。省略了酶蛋白分离纯化的步骤;优化培养基组分及连续补料发酵提高了单位细胞表达的酶活力、细胞干重和总产量;优势辅因子的加入使表面展示基因工程菌的活性和稳定性进一步提高;通过理性设计、分子动力学模拟解析影响酶热稳定性的关键功能氨基酸位点,对拟突变体进行分子动力学二次模拟筛选得到热稳定性良好的α-Gal突变株,并进行实际突变。最后将野生型酶和实际突变稳定性良好的突变体与不同棉子糖族低聚糖和半乳甘露聚糖小分子模型底物进行分子对接,研究酶结构的改变对不同底物催化活性的影响机制。主要研究结果如下:1、以食品安全级酿酒酵母EBY100为细胞表面展示的宿主菌,表达了来源于水稻的riceα-Gal II,获得全细胞催化单元YSD riceα-Gal II,酶活力为240.6 U/g,细胞干重为1.0 g,总产量为243.6 U（1 L YNB-CAA培养液中）。添加复合氮源（硫酸铵/尿素=2/1,w/w）0.6 g/L,蔗糖5 g/L,连续补充半乳糖至终浓度20 g/L,（流速为1.5 mL/h）,最佳酶活力为507.2 U/g、细胞干重3.0 g和总产量1548.5U。此外,还发现与5 mM的Vc共表达,酶蛋白含量提高了5.1倍,综合上述两种方法,1 L培养液可获得的酶活力、细胞干重和产量大幅度提高分别至1905.3 U/g,4.2 g,8021.3 U,分别是优化前的7.9倍,4.2倍和32.9倍。2、YSD riceα-Gal II的最适反应温度为45 oC,最适反应pH值为5.0。热稳定性随温度升高而急剧下降,pH稳定性范围为4.0-6.0。对p-Nitrophenyl-α-D-Galactopyranoside（pNPG）的水解活力最高,对棉子糖族低聚糖也具有高水解性,可以在水解豆粕和瓜尔胶等长效反应体系中保持良好的稳定性。通过研究不同辅因子对酶活性及稳定性的影响,发现了6种优势辅因子Vc、Fe3+、EDTA、尿素、精氨酸和木糖醇,其中精氨酸使酶活力提高最多为原酶的178.7%,温度和pH稳定性为10-20 oC和4.5-6.5;木糖醇将YSD riceα-Gal II的温度和pH稳定性分别拓宽到10-25 oC和3.5-7.0。冷冻干燥后在室温下储藏90天,残存酶活仍能保持90.0%。3、运用SWISS-MODEL同源模拟riceα-Gal II蛋白质三维结构,GROMACS分子动力学模拟预测热不稳定氨基酸残基和拟突变体的二次模拟,筛选正向突变菌株。基于此模拟结果,进行定点突变和N-端截短突变,实验验证得到稳定性良好的突变体R167E、R167V、D285V、D285G和N9。50 oC下野生酶的残存酶活为19.5%,突变体R167E、D285V、D285G和N9的残存酶活分别提高到30.4%、65.9%、45.8%和78.5%;60 oC下野生酶完全失活,突变体R167E、D285V、D285G和N9的残存酶活分别提高到30.0%、49.3%、35.3%和39.7%。R167E、R167V和N9使pH稳定范围由原来的4.0-6.0拓宽到4.0-6.5;D285V、D285G和N9提高了酶碱性pH范围内的稳定性。R167V和D285G对pNPG的Kcat/Km值高于野生型,酶促动力学结果优于野生酶。对于p NPG的水解力,R167V是野生酶的108.0%,但对天然底物水解力低;D285V和D285G对棉子糖和水苏糖的水解力高于野生型,对蜜二糖和瓜尔胶的水解力下降;N9对蜜二糖的水解力提高,对瓜尔胶的水解力为仅为野生型的56.6%。4、基于上述突变体对不同底物水解能力的差异性,运用分子对接技术,将蜜二糖、棉子糖及半乳甘露聚糖的两个小分子模型Gal3Man3（G3M3）和Gal3Man4（G3M4）分别与riceα-Gal I（同源建模的模板）,riceα-Gal II和突变体D285G、D285V和N9的活性中心进行对接。Riceα-Gal I与蜜二糖的结合作用强于riceα-Gal II,与棉子糖、G3M3和G3M4的结合作用均远低于riceα-Gal II,是因为酶活性中心的loop1、α2-螺旋、α5-螺旋、α6-螺旋、α7-螺旋和α8-螺旋结构和C-端与底物有识别作用的β9-折叠上的氨基酸差异,改变了底物进入riceα-Gal I活性腔的方向,未能完全包埋于活性腔内,riceα-Gal I中的两个关键催化氨基酸Asp130和Asp185未能参与催化作用,造成了两个酶对底物糖链结合作用的差异。3种突变体对蜜二糖的结合能力提高;D285V与riceα-Gal II对棉子糖的结合能力相近,而D285G和N9的明显低于前两者;riceα-Gal II对G3M3/G3M4的水解效力最高,因而对半乳甘露聚糖水解效力最好,其他依次为突变体D285V、D285G、N9,造成N9对两个半乳甘露聚糖小分子的水解力严重下降的原因是N-端截短后所剩的一个非催化中心的氨基酸Pro对进入活性腔的底物形成了空间位阻,影响底物进入活性腔内与关键作用氨基酸的结合。分子对接的结果与底物特异性试验数据趋于一致,并进一步从分子水平阐明了α-Gal对不同底物的催化机制。