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植物过氧化物酶的作用底物具有多样性,导致其功能多样性,但在基因结构上存在保守性,其同源性可以达到80%左右。因此,本实验室所构建的RNAi抑制质粒的核苷酸序列是选用萝卜过氧化物酶rsprxl基因的保守序列以期取得有效的抑制效果。本实验室前期的实验结果表明:在萝卜生长期通过注射方法将所构建载体导入萝卜肉质根可以有效地抑制萝卜过氧化物酶基因的表达。但是,注射后的第一次取样时间是在注射后的72h,72h内的变化无从了解,用农杆菌介导直接浸染萝卜的肉质根小块,可以在浸染后的不同时间内,有效观察短时间的抑制效果。为此本实验选择不同浸染时间,以及浸染后培养不同时间观察其抑制效果。光是植物生长的必不可少因素,光也是植物花青素合成重要影响因素之一,本实验模拟心里美萝卜自然生长条件,以及强光和黑暗培养条件,在前期研究基础上进行RNAi干扰POD基因表达,观察光照强度对RNAi干扰效果的影响。
实验结果表明,在心里美萝卜生长的不同时期,采取萝卜肉质根进行转染,POD活性的抑制作用最强效果是在萝卜播种后生长至第79天的时期,无论是位于生长期还是贮藏期,浸染后培养4h时,POD活性开始受到抑制,48h达到最底点,浸染时间越长,抑制作用越明显。但随浸染时间延长,至72h时抑制作用有减低趋势。本实验进~步证实POD活性被抑制的时间可以提前到RNAi干扰质粒作用后的4h,面花青素的含量随POD活性被抑制而逐渐增加。说明植物的生长状态可以影响到干扰强弱,对干扰趋势影响不明显。
CAT和POD是植物体内的主要抗性酶,共同调节着植物体内H2O2的含量。在本实验中,当POD活性下降时,伴随着CAT活性的升高以及H2O2含量的增加,说明CAT与POD共同协调细胞内的抗氧化体系。从H2O2含量增高的结果分析,在植物的抗氧化体系中POD对H2O2含量的调节起着举足轻重的作用。
实验结果表明,强光可以显著增加pOD活性,RNAi对POD活性的抑制趋势相同,但强光明显减弱抑制效果。黑暗对POD活性影响及RNAi的干扰作用和中等光照类似。但在不同光照强度下,花青苷的含量却有很大的差异,强光照下花青苷含量在光照后4h即成倍增加,其后保持相对稳定。中度光照下花青苷含量增加出现在24h,黑暗下出现在48h。抑制POD基因表达后,强光照和中度光照的花青苷含量均在4h后出现增高并在48h达到高峰,而黑暗组则在8h后,且72h时这种增高不再出现,这进一步说明,光照是花青素合成的关键因素,而POD活性的高低与花青素含量密切相关,抑制POD基因表达,减低POD活性,可以增加花青素的含量。抑制RsPrxl基因的表达使酰化花青苷的积累增加,最终导致了不同花青苷相对含量的改变和花青素的积累。
综上所述,本实验室依据心里美萝卜POD基因(rsprxl)的保守序列所构建的RNAi双元表达载体(pART-rsprxli)能有效地抑制心里美萝卜的POD活性。