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目的:用H2O2处理作为氧化应激刺激因素来诱导hPDLCs衰老,观察Met对hPDLCS衰老的作用,初步探索其作用机制。同时观察在H2O2和Met的作用下,hPDLCs成骨分化能力的变化。方法:1 hPDLCs的分离培养和鉴定:I型胶原酶消化人牙周膜,组织块贴壁法进行hPDLCs的原代培养;倒置显微镜下观察细胞形态,成软骨、成骨、成脂诱导后阿利新蓝、茜素红、油红O染色鉴定其多向分化能力,流式细胞术检测干细胞表面标志物（CD34、CD73、CD146和Stro-1）;取第3代hPDLCs用于后续实验。2 H2O2诱导hPDLCs衰老:用不同浓度的H2O2（50μM,100μM,200μM,300μM,500μM）处理hPDLCs,用CCK-8试剂盒检测细胞在0、1、3、5、7天的活性,用流式细胞术检测细胞凋亡,筛选明显抑制hPDLCs活性但不显著促进其凋亡的最适H2O2浓度。倒置显微镜下观察hPDLCs在最适H2O2浓度处理后的形态和衰老标志物SA-β-gal染色情况;并对H2O2处理后的hPDLCs进行成骨诱导,诱导7天后进行RT-qPCR检测成骨相关的基因（col-1、ocn、opn、runx2）的表达。3 Met对氧化应激损伤的影响:用不同浓度的Met（50μM,100μM,200μM,300μM,500μM）处理hPDLCs,CCK-8检测hPDLCs在0、1、3、5、7天的活性,以观察Met对hPDLCs是否具有细胞毒性。用Met预处理hPDLCs后,再用最适浓度的H2O2处理,进行ROS活性检测,检测氧化应激损伤标志物（MDA和p-H2A.X）。4 Met对hPDLCs衰老和成骨分化能力的影响:Met预处理hPDLCs后再用H2O2处理,然后进行CCK-8检测、SA-β-gal染色、衰老相关的基因（p16、p21、p38、p53）RT-qPCR检测。并且在Met和H2O2处理后进行成骨诱导,在诱导第7天进行ALP染色和ALP活性检测,在诱导第21天进行茜素红染色和氯化十六烷基吡啶萃取钙结节定量。5自噬在Met抗hPDLCs衰老中的作用:先用自噬抑制剂3-MA预处理hPDLCs,再用Met和H2O2处理。通过WB实验来检测自噬相关蛋白P62、BECLIN1的表达和LC3-I向LC3-II的转化,以及衰老相关蛋白P16、P21的表达。结果:1原代hPDLCs从牙周膜组织块周围爬出,贴壁生长,呈长梭形、多角形和不规则形状;hPDLCs经成软骨、成骨、成脂诱导后分别进行阿利新蓝、茜素红、油红O染色,结果皆为阳性;间充质干细胞特异性表面标志物表达如下:CD73:98.58%,CD146:85.89%,Stro-1:0.29%,造血系细胞表面抗原表达为CD34:0.13%。以上结果证明,培养出来的细胞是牙周来源而非骨髓来源,且具有多向分化的干细胞特性。2 H2O2浓度大于100μM时,可抑制hPDLCs的活性,且随着H2O2的浓度增高,抑制作用越明显。H2O2的浓度达到和超过200μM时可以促进hPDLCs凋亡,当浓度不超过100μM时,没有明显的促凋亡作用。在100μM的H2O2作用后,镜下观察hPDLCs形态,发现细胞不再是典型的长梭形结构,而是呈现面积变大、形状扁平的衰老样。衰老标志物SA-β-gal染色发现,H2O2处理后蓝染细胞增多。H2O2处理后的hPDLCs成骨诱导7天,成骨相关的基因（col-1、ocn、opn、runx2）表达明显降低。因此可用100μM H2O2处理,成功诱导hPDLCs衰老。3不同浓度Met处理hPDLCs后,细胞活性不受影响。H2O2引起hPDLCs细胞内ROS活性增强,Met预处理可以减少细胞内ROS的产生。Met浓度在100μM时,减少ROS的作用效果开始显著。并且,Met处理后,可以明显减少H2O2引起的氧化应激损伤标志物（MDA、p-H2A.X）的产生。以上结果说明Met具有抗氧化应激损伤的作用。4 CCK-8结果显示,Met预处理可以减少H2O2对细胞活性的抑制;同时,也减少了衰老标志物SA-β-gal的产生,降低了衰老相关基因（p16、p21、p38、p53）的表达。ALP染色、ALP活性检测和茜素红染色结果均显示H2O2处理后的hPDLCs成骨分化能力下降,Met预处理可以部分恢复hPDLCs成骨分化的抑制作用。5相对于对照组而言,H2O2处理后hPDLCs的BECLIN1蛋白量增多,LC3-I向LC3-II的转化增多,即H2O2本身能够促进自噬。Met预处理能进一步促进hPDLCs自噬,自噬抑制剂3-MA处理后,自噬明显减弱。H2O2能够明显促进衰老相关蛋白P16和P21的表达,Met能够抑制H2O2引起的P16和P21升高,3-MA处理逆转了Met的这种作用。结论:1以H2O2为氧化应激刺激因素,可以成功建立hPDLCs衰老的体外模型,衰老的hPDLCs成骨分化能力降低。2 Met能够减轻H2O2导致的hPDLCs氧化应激损伤和衰老,从而部分恢复hPDLCs的成骨分化能力。3本实验初步探索了Met减轻氧化应激损伤引起hPDLCs衰老的机制,发现自噬可能参与了其中。