论文部分内容阅读
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),是一种食源性胞内致病菌,该菌可穿越人和动物肠屏障、血胎屏障及血脑屏障,在临床上引起脑膜炎、脑膜脑炎、败血症及孕畜(妇)流产等疾病,临床病死率可达到20％-30%。LM引起中枢系统疾病过程中涉及许多毒力因子,尤其是内化素家族蛋白InlA、InlB、InlJ等毒力因子在黏附、侵袭宿主细胞中扮演重要角色,但这些毒力因子在 LM穿越宿主血脑屏障过程中具体机制尚不清楚,本研究以4b型食源性LM681及临床绵羊脑炎分离株LM90为亲本株,构建inlA、inlB和inlJ基因单缺失突变株,培养鼠脑微血管内皮细胞,体外构建血脑屏障模型,为进一步研究inlA、inlB和inlJ毒力因子在LM穿越血脑屏障过程中具体作用及机制奠定基础。主要研究内容和结果如下: 1、LM681、LM90内化素基因inlA、inlB、inlJ单缺失突变株的构建:运用融合 PCR( SOE-PCR)和同源重组技术构建 LM单基因缺失株 LM90-△X和LM681-△X(X为 inlA、inlB、inlJ)。37℃、无氯霉素压力条件下传代培养15代,PCR检测无毒力返祖现象,表明突变菌株具有良好的遗传稳定性。 2、LM基因缺失株部分生物学特性的研究:以亲本株为对照,inlA、inlB及inlJ基因突变株对小鼠 LD50高出101.5、101.3和101.33倍,但差异不显著;溶血性无差异;对鼠脑微血管内皮细胞(MBMEC)的黏附率、侵袭率及不同时间段内胞内增殖能力都明显降低,其中侵袭率差异极显著(P<0.05),inlB缺失后小鼠肝、脾、脑载菌量降低但差异不显著,各基因缺失株耐碱不耐酸特性与亲本株基本一致,但耐碱性高于亲本株。结果表明,inlA、inlB和inlJ基因的缺失可减弱LM毒力,inlB和inlJ与LM抗酸应激相关。 3、LM基因缺失株感染MBMEC后对细胞骨架与细胞间紧密连接的影响: LM和各缺失株感染MBMEC后,通过免疫荧光标记作用后发现,LM和LM90-△inlJ引起细胞骨架(F-act)重塑,LM90-△inlA对细胞骨架重塑不明显,LM90-△inlB则骨架基本完整;亲本株和突变株都可改变MBMEC紧密连接。试验结果表明:InlB能够影响MBMEC细胞骨架重塑,InlA影响次之,而InlJ的则在此过程影响较小或没有影响。LM可引起细胞间紧密连接改变,而InlA、InlB和InlJ在该过程中可能不发挥作用。这为研究LM如何穿越宿主的血脑屏障造成脑膜脑炎的分子机制提供了科学依据。