研究背景和目的神经胶质瘤是一类恶性程度非常高的脑部肿瘤,由于该肿瘤的高侵袭性、耐药性、抗放疗性、早期转移、原位复发等特性,大部分的患者的生存期都很短,只有1年左右。经研究证实,notch信号通路在神经胶质瘤的发生和发展过程中具有非常重要的作用。Notch信号通路的过度活化可能是导致恶性胶质瘤发生的重要因素,在notch信号通路活化的过程中,γ-分泌酶（γ-secretase）起着非常重要的作用。γ-secretase是由多个亚单位组成的高分子量蛋白酶复合体,它的确切组成仍然不清楚。研究表明功能性的γ-secretase蛋白酶复合体主要由以下四种蛋白组成：Presenilin （PS）、Nicastrin、Pen-2、Aph-1,它们被认为是γ-分泌酶活性组成部分,这四种蛋白的功能还不是很清楚,Presenilin是一种天氡胺酰蛋白酶,它可能是γ-secretase蛋白酶复合体的催化亚单位；Nicastrin可能在稳定γ-secretase蛋白酶复合物和调控细胞内蛋白质运输中发挥作用；Pen-2通过与Presenilin的跨膜区域结合而与此复合物发生联系的,他的另个一个功能可能是在Presenilin蛋白水解所产生的活化的N-氨基末端和C-氨基末端后维持蛋白酶复合物的稳定性；Aph-1是蛋白水解作用所必须的,它通过一个保守的α螺旋相互作用的碱基序列结合到该蛋白酶复合物上,它主是是协助一系列的早熟成份的起动。γ-分泌酶与多种疾病发系密切,如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）、脑神经胶质瘤（Brain gliomas）等。阿尔茨海默病属于常染色体显性遗传性疾病,是老年多发病之一,AD的发病与编码早老素-1（Presenilin 1,ps-1）和早老素-2（Presenilin 2,ps-2）导致的γ-secretase功能异常有关。鉴于γ-分泌酶（γ-secretase）是notch信号通路重要的调控蛋白,因此,利用γ-分泌酶抑制剂（Gamma secretase inhibtor-Ⅰ, GSI-I）抑制γ-分泌酶的活性,从而抑制notch信号通路的过度活化,对神经胶质瘤的治疗有一定的研究价值。博来霉素（Bleocin,BLM）是一种常用的抗肿瘤药,临床主要用于治疗肺癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、头颈部及皮肤鳞状癌。BLM主要抑制胸腺嘧啶核苷参入DNA,与DNA结合使之破坏分解,作用于增殖细胞周期的S期,从而抑制肿瘤细胞的增殖。那么BLM是否也能抑制胶质瘤细胞的增殖呢?本研究以U87、U251胶质瘤细胞株为模型,探讨γ-分泌酶抑制剂（Gamma secretase inhibtor-Ⅰ, GSI-I）和博来霉素（Bleocin,BLM）对恶性脑胶质瘤细胞株的增殖和凋亡影响。本研究首先利用RT-PCR法检测Notch受体及其靶基因Hes-1在U87、U251胶质瘤细胞中的表达.由于Hes-1是Notch通路调节的主要靶基因之一,通过检测Hes-1基因的表达水平即可确定Notch通路的活化程度。因此,我们以荧光定量RT-PCR法定量分析GSI-Ⅰ对Notch通路的抑制作用；同时,应用MTT法分析GSI-Ⅰ和抗肿瘤药物博来霉素（Bleocin,BLM）对上述两种细胞的增殖抑制作用。下一步,我们利用流式细胞仪检测了GSI-和BLM对U251、U87这两种细胞株的细胞周期影响及诱导凋亡的作用。最后,采用蛋白印迹（western blot）技术进一步分析了GSI-对U251、U87细胞的周期蛋白表达的影响。方法1.U87和U251神经胶质瘤细胞的培养U87、U251胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,置37℃、5%的co₂培养箱培养,实验取对数生长期细胞。2. notch信号通路受体及其下游基因Hes-1的检测取对数生长期的U87、U251胶质瘤细胞,按照Trizol说明书提取总RNA,行RT-PCR检测notch受体及其下游基因Hes-1的表达3.GSI处理后Hes-1表达水平的检测U87胶质瘤细胞经1μmol/L GSI和2.5μmol/L GSI分别处理4h,24,48h后,提取总RNA行荧光定量RT-PCR检测Hes-1的表达水平。4.检测GSI处理后对U87和U251胶质瘤细胞增殖能力的的影响取生长良好的U87和U251细胞细胞,用不同浓度的GSI处理,实验同时设阴性对照组,48h后,置酶标仪570nm波长测各孔OD值,分析细胞的增殖能力。5.检测GSI+Bleocin对U87、U251胶质瘤细胞的抑制作用的协同效应实验分为阴性对照组、GSI各浓度组、Bleocin各浓度组及GSI+Bleocin各浓度组,处理48h后MTT法分析GSI、Bleocin和GSI+Bleocin对U87和U251细胞的增殖抑制作用。6.GSI对U87和U251细胞周期的检测U87和U251细胞经GSI处理48h后,收集细胞并用70%的乙醇固定至少6小时,流式细胞仪分析GSI分别对U87和U251细胞周期各期的作用,同时,利用蛋白印迹检测GSI对U87和U251细胞周期蛋白的影响。7.检测GSI、Bleocin、GSI+Bleocin对U87和U251细胞凋亡的影响不同浓度的GSI、Bleocin、GSI+Bleocin处理后,收集细胞,Annexin V/PI双染法流式细胞术检测GSI对胶质瘤细胞株U87、U251的诱导调亡作用。8.统计学方法实验数据均用SPSS10.0统计软件处理,荧光定量RT-PCR实验采用重复测量数据的方差分析,细胞周期实验采用独立样本的t检验（Independent t Test）,细胞增殖抑制实验、凋亡分析实验采用方差分析（One-way ANOVA）, GSI+Bleocin协同效应实验采用析因设计的方差分析。本实验的主要结果和结论如下：1.成功培养了人源性的U87、U251神经胶质瘤细胞株,通过RT-PCR法,检测到notch受体及notch信号通路下游的靶基因Hes-1在U87、U251胶质瘤细胞株中均有表达,说明notch信号通路在U87、U251胶质瘤细胞中是存在的。2.GSI-Ⅰ可以通过抑制γ-secretase的活性,从而抑制notch信号通路的活性,notch信号通路被阻断以后,其下游靶基因Hes-1的表达就会减少,因此,我们用GSI-Ⅰ处理U87、U251胶质瘤细胞4-48小时,经荧光定量RT-PCR检测,结果显示,不同浓度的GSI分别处理4h,24h,48h后,Hes-1的表达显著下降,差异具有统计意义（F=14.965,P=0.000）。以上结果说明经GSI处理后,notch信号通路下游靶基因Hes-1的表达与control组相比显著性降低,并呈现出剂量依赖性,说明GSI-Ⅰ能有效抑制U87、U251胶质瘤细胞中的notch信号通路的活性。3.既然GSI-Ⅰ能抑制U87、U251胶质瘤细胞中的notch信号通路的活性,那么GSI-Ⅰ是否对U87、U251胶质瘤细胞增殖有抑制作用呢?因此,我们检测了不同浓度的GSI-Ⅰ对U87、U251胶质瘤细胞增殖抑制作用,48h后行MTT法检测,结果显示,2.5μmol/L及以上浓度的GSI能显著抑制这两种肿瘤细胞的增殖,差异具有显著性（F=11.174,P=0.000）和（F=92.755,P=0.000）。说明2.5μmol/L及以浓度的GSI对U87、U251胶质瘤细胞有显著的增殖抑制作用,且该抑制作用呈剂量依赖型增加。而低浓度的GSI-I （0.5μmol/L或1μmol/L）对细胞的抑制作用无显著差异,说明GSI-Ⅰ对胶质瘤细胞有毒作用,但必须达到一定的浓度。4.博来霉素（Bleocin,BLM）能抑制一些常见的肿瘤细胞的增殖,它是否能用于神经胶质瘤的治疗目前还没有这方面的报道。为此,本实验研究了BLM+GSI对神经胶质瘤细胞增殖抑制是否具有协同效应。实验证明BLM+GSI比单用GSI处理对U87和U251细胞的增殖抑制作用更加显著,有统计学差异（F=4.217,P=0.000）和（F=3.863,P=0.001）。说明GSI+BLM联用对胶质瘤细胞的增殖抑制作用具有协同效应,我们推测,BLM抑制神经胶质瘤细胞增殖的机理可能与其它肿瘤相似,也是通过作用于神经胶质瘤细胞的增殖周期而抑制其增殖。5．为了进一步阐明GSI-Ⅰ抑制胶质瘤细胞增殖的机制,实验中首先我们通过流式细胞仪检测了GSI-Ⅰ对U87及U251细胞周期的影响。加入DMSO或2.5μmol/L的GSI-Ⅰ作用48h后,收集细胞并行细胞周期的检测,结果显示,GSI-Ⅰ作用于U87胶质瘤后,处于S期的细胞显著减少（从24.8±1.50%下降到9.34±0.53%）,具有统计学差异（t=16.870,P=0.000）,同时G1期细胞增多（从43.80±1.99%上升到52.96±1.36%,t=-6.587,P=0.003）,说明GSI-Ⅰ使U87细胞阻滞在G1期。在U251细胞中也检测到S期细胞减少（从26.00±3.42%下降到17.37±3.41%,t=3.098,P=0.036）,但G1期细胞同样减少（从63.57±4.63%下降到35.66±5.41%,t=6.792,P=0.002）,并且G2期细胞显著增加（从10.43±1.39上升到46.97±2.24%,t=-24.027,P=0.000）,说明GSI-Ⅰ对U251细胞的作用主要是G2期阻滞。G1期阻滞说明细胞增殖受到抑制,而G2期阻滞则意味着凋亡即将发生。下一步我们采用蛋白印迹（western blot）分析了GSI对U87及U251细胞周期蛋白Akt、S6K、CDK2、CyclinB1和CyclinD1表达的影响。U87、U251胶质瘤细胞经不同浓度的GSI （1μmol,2.5μmol,5μmol,10μmol）处理48h后,提取不同处理组总蛋白,检测Akt、S6K、CDK2、CyclinB1和CyclinD1表达的表达。结果显示,GSI-Ⅰ作用后两种细胞的Akt及S6K的磷酸化程度略有降低。U87细胞的Cyclin D1表达下调,U251细胞的Cyclin B1表达下调,两种细胞的CDK2都有明显下调。说明GSI-Ⅰ对胶质瘤细胞株的抗凋亡及细胞周期蛋白的活性及表达有影响。这可能是GSI-Ⅰ抗胶质瘤效应的分子机制之一。从上述结果分析,GSI-Ⅰ对胶质瘤细胞的毒性作用不仅体现在抑制增殖,还可能直接诱导凋亡。因此,我们进一步检测了GSI-Ⅰ对这两种胶质瘤细胞株的促凋亡作用。6.实验中我们分别用不同浓度度的GSI-Ⅰ作用于U87及U251胶质瘤细胞,作用时间分别是24h和48h,结果显示,GSI作用24h后,随差GSI浓度的增加,U87细胞的调亡率增加（从2.24±0.23%上升到7.63±0.63%）,差异有统计学意义（F=116.545,P=0.000）,U251细胞的调亡率也有增加（从2.72±0.73%上升到6.17±0.45%）,差异有统计学意义（F=27.734,P=0.001）,作用48h后,U87和U251细胞的调亡率也显增加,具有统计学差异（分别为F=144.651,P=0.000；F=211.295,P=0.000）。以上结果说明GSI-Ⅰ作用于胶质瘤细胞有显著的促凋亡作用,而该作用在不同的胶质瘤细胞株中存在差异。U251细胞较之U87细胞更容易被GSI-Ⅰ诱导凋亡。7.我们还进一步分析了GSI—Ⅰ.Bleocin和Bleocin+GSI对U87、U251胶质瘤细胞的促凋亡作用,用1μmol／L GSI—Β,1μmol／L Bleocin,1μmol／L GSI—Ⅰ+1μmol／L Bleocin处理U87胶质瘤细胞,用2.5μmol／L GSI—Ⅰ,1μmol／L Bleocin,2.5μmol／L GSI—Ⅰ+1μmol／L Bleocin处理U251细胞,48h后用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,结果显示,1μmol／L的GSI-Ⅰ对U87细胞的调亡率为9.217±0.440%（P=0.000）,1μmol／L的Bleocin对U87细胞的调亡率为8.343+0.778%（P=0.001）,1μmol／L GSI—Ⅰ+1μmol／L Bleocin对U87细胞的调亡率为21.160±1.423%（P=0.000）。2.5μmol／L GSI—Ⅰ对U251细胞的调亡率为21.883±2.054％（P=0.000）,1μmol／L的Bleocin对U251细胞的调亡率为8.343±0.776％（P=0.015）,2.5μmol／L GSI-Ⅰ+1μmol／L Bleocin对U251细胞的调亡率为60.980±2.015%（P=0.000）。上述结果进一步说明GSI+Bleocin对胶质瘤细胞的增殖抑制具有协同效应,其相关分子机制还有待进一步的研究。