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目的:高血压病是严重危害人类健康的常见病,主要表现为小动脉与微动脉张力增加,不能对抗增高的血管紧张度及对血管活性物质做出正常反应,出现持续的血压增高。肠系膜动脉作为人体主要的内脏血管,在全身的动脉中所占比例最大,是形成外周阻力的主要血管,对血管活性物质敏感,对血压的影响具有重要意义。大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium—activated potassium channels,BKCa)是血管平滑肌上主要的负反馈调节器,在血管的舒张调节中发挥着关键作用。雌激素(estrogen,E2)是女性体内重要的内分泌激素,具有广泛的生物学效应。流行病学资料显示,高血压病存在明显的性别差异,绝经前妇女高血压的发病率明显低于同龄男性,但绝经后这种差别则不复存在。研究表明雌激素对于女性正常心血管功能的维持和调节具有重要意义,有可能通过功能性的雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)调节血管平滑肌的结构和功能,但机制尚不明确。本实验采用单通道膜片钳技术,观察原发性高血压患者肠系膜动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)BKCa电流及BKCa对E2及雌激素受体特异性抑制剂ICI182780的敏感性变化,探讨E2、ER、BKCa与原发性高血压之间的关系。
方法:将分离好的肠系膜动脉,纵向剖开剪成2 mm×2 mm的组织条块,置于酶液中进行两步消化。选取具有较强立体感,表面光滑的平滑肌细胞进行实验,采用单通道膜片钳技术记录电流。电流信号经膜片放大器放大,1KHz低通滤波,再经12位A／D、D／A转换器在专用软件pClamp支持下记录储存于计算机硬盘内。采用频率为10 KHz,采样方式为Gap Free。观察并比较原发性高血压组(hypertension group,HT)和正常血压组(normotensiongroup,NT)应用E2和ICI182780前后的BKCa电流。
结果:1.在对称性高钾溶液中,内面向外式膜片(inside-out patch)记录方式下,平滑肌细胞BKCa通道NT组和HT组电导值分别为175.2±21.4 pS(n=7)和183.5±29.6 pS(n=6),两组电导值无显著差异(P>0.05)。2.BKCa通道的电压依赖性:在细胞贴附式膜片(cell-attached patch)和内面向外式膜片(inside-out patch)下,NT组(n=7)和HT组(n=6)的BKCa通道开放概率(Open Probability,Po),电流幅度值(Amplitude,Am)和平均开放时间(Mean Open Time,To)均随膜电位增加(+10mV、+20 mV、+30 mV、+40 mV、+50 mV、+60 mV)而显著增大(PNT<0.01,PHT<0.01)；两组平均关闭时间(Mean Close Time,Tc)均随膜电位增加而显著降低(PNT<0.01,PHT<0.01)。3.BKCa通道的Ca2+依赖性:在inside-out patch记录下,NT组(n=7)和HT组(n=6)通道在膜电位为+40 mV时的Po、To均随[Ca2+]i增加(10-8M、10-7M、5×10-7M、10-6M、10-5M)而显著增大；HT组Po、To增加的幅度小于NT组；两组Am增加均不明显；两组Tc均随Ca2+增加而显著降低；HT组的Po、To与NT组比较,差异性有统计学意义(P<0.05)。4.在outside-out patch记录下,BKCa的特异性阻断剂Iberiotoxin(200 nM IbTX)可阻断BKCa电流。5.E2及ER特异性阻滞剂(ICI182780)对BKCa通道的作用:①在cell—attached patch下,E2对BKCa通道作用明显。NT组(n=7)和HT组(n=6)BKCa通道在加入E2(100μM)后的Po分别从0.022±0.004增加到0.089±0.009,从0.030±0.007增加到0.062±0.004,同组加E2前后比较以及加E2后两组之间比较,都存在明显的差异(PNT<0.01,PHT<0.01,PNT／HT<0.05)。②在cell-attached patch下,待NT组(n=7)和HT组(n=6)在加入E2稳定后再加入ICI182780(100μM),ICI182780对BKCa通道有明显抑制作用。NT组和HT组通道的Po均在加入ICI182780后,分别减少到0.031±0.001和0.045±0.011,正常血压组加药前后差异性显著,而高血压组加药前后比较以及加药后两组之间比较,差异性均不明显(PNT<0.01,PHT>0.05,PNT／HT>0.05)。③在②的基础上继续加入E2(100μM),BKCa通道作用不明显。
结论:1.急性酶分离的人肠系膜动脉平滑肌细胞的BKCa电流有明显的电压依赖性和Ca2+依赖性,且HT组对Ca2+的敏感性比NT组低。2.E2显著增加人肠系膜动脉平滑肌细胞的BKCa开放频率,之后再加入的ICI182780可降低人肠系膜动脉平滑肌细胞的BKCa开放频率,ER在E2快速引起血管舒张反应中起着主要作用。3.HT组血管平滑肌细胞上BKCa对E2和ICI182780的反应性比NT组低。4.E2对BKCa的激活部分是通过ER发挥作用的。