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背景与目的:细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)是Rho GTPases家族的成员之一,对细胞形态、极性和细胞增殖等各种细胞功能具有调节作用。研究表明,Cdc42不仅参与胰岛素的合成过程,还通过激活一系列下游因子调节胰岛素颗粒的动员与细胞质膜的胞吐作用。此外,Cdc42还调控间充质干细胞的增殖、迁移与分化。在MSCs中敲低Cdc42会显著抑制细胞的增殖。Wnt/β-catenin信号通路对胰腺发育和胰岛功能至关重要。研究发现β-catenin在胰腺发育的后期阶段能促进胰腺的发育与胰腺细胞增殖。然而,它对β细胞发育和功能的确切影响仍存在争议。最近的体外实验证实Wnt/β-catenin通路能促进脂肪间充质干细胞(ADSCs)分化为胰岛β样细胞。而Cdc42可以通过调控Par6/a PKC复合体的形成从而对APC以及GSK3β两种存在于Wnt/β-catenin通路中的下游信号转导分子进行活性调节影响细胞的增殖与迁移。本研究旨在探讨Cdc42是否通过Wnt信号通路对ADSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)产生影响。方法:1、观察ADSCs中内源性Cdc42的表达情况。正常培养ADSCs三天后,用蛋白免疫印迹法检测细胞中Cdc42的表达水平,并与Min6细胞进行比较。2、验证ADSCs是否成功诱导分化为IPCs。用DMSO和高糖条件对ADSCs进行诱导。于诱导第3、6、10天用显微镜观察细胞形态变化。诱导10天后,双硫腙染色法检测胰岛β细胞的诱导生成情况。q PCR法检测诱导细胞中与胰岛β细胞生长发育相关的PDX1、Insulin、Ngn3、Neuro D1、GLUT2基因的表达情况。3、观察Cdc42抑制剂ML141对诱导后IPCs中Cdc42的抑制情况。于诱导第二天在诱导培养基中加入ML141,诱导结束后,蛋白免疫印迹和q PCR法测定细胞中Cdc42的表达量。4、观察ML141是否通过Wnt/β-catenin通路影响ADSCs诱导分化为IPCs以及分化后细胞的增殖情况。于细胞诱导第二天按实验分组情况加入ML141、Wnt通路的激活剂(Wnt-3a)。分组为:空白对照组、空白对照+Wnt-3a组、诱导组、诱导+Wnt-3a组、诱导+ML141组、诱导+ML141+Wnt-3a组。诱导结束后,蛋白免疫印迹和q PCR法测定IPCs中与胰岛细胞生长发育相关基因(PDX1、Insulin、Ngn3、GLUT2、Neuro D1)和Wnt通路相关基因(β-catenin、Dvl2、GSK3β、p-GSK3β、TCF7L2)的表达情况。CCK测定诱导细胞的增殖能力。免疫荧光检测IPCs中胰岛素的表达。结果:1、ADSCs中存在内源性Cdc42的表达,与Min6细胞相比,Cdc42蛋白的表达量更高(P<0.01)。2、DMSO和高糖条件诱导10天后,诱导组细胞呈胰岛样细胞簇聚集生长,双硫腙染色法检测到胰岛β细胞的生成。诱导分化的IPCs中存在PDX1(P<0.05)、Insulin(P<0.01)、Ngn3(P<0.01)、Neuro D1(P<0.05)基因的表达,且PDX1、Insulin、Ngn3、Neuro D1的基因表达水平均高于未诱导组。3、浓度为10μM的ML141一定程度上抑制了诱导后IPCs中Cdc42(P<0.01)的表达。4、在诱导培养基中加入Wnt-3a后细胞中β-catenin(P<0.05)、TCF7L2(P<0.05)表达量增加;加入ML141,IPCs中β-catenin(P<0.01)、Dvl2(P<0.01)、p-GSK3β(P<0.05)、TCF7L2(P<0.01)基因的表达显著降低,非磷酸化的GSK3β的蛋白表达量显著升高(P<0.01)。在存在Wnt-3a的情况下,于诱导培养基中加入ML141,与Wnt-3a诱导组相比,GSK3β的表达显著增加(P<0.01,P<0.05),β-catenin(P<0.01)、Dvl2(P<0.01)、TCF7L2(P<0.01)、p-GSK3β(P<0.05)的表达量降低。在诱导培养基中加入Wnt-3a,IPCs细胞中Ngn3、Insulin、GLUT2的表达明显增加(P<0.01),细胞增殖速率升高(P<0.01);在诱导期间加入ML141,细胞中PDX1(P<0.01)、Insulin(P<0.05)、Ngn3(P<0.01)的蛋白表达量显著降低,细胞增殖速率降低(P<0.01)。在含Wnt-3a的诱导培养基中加入ML141进行诱导,与Wnt-3a诱导组相比,IPCs中PDX1(P<0.01)、Ngn3(P<0.01)、Insulin(P<0.05)、GLUT2(P<0.01)的表达均降低,细胞增殖速率降低(P<0.01)。结论:1、ADSCs中存在内源性Cdc42的表达,且表达量较高。2、DMSO和高糖条件能成功将ADSCs诱导分化为IPCs。3、抑制Cdc42对Wnt/β-catenin通路和IPCs细胞增殖起抑制作用。Wnt/β-catenin通路能促进ADSCs向IPCs的分化,Cdc42可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响ADSCs诱导为IPCs。