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近年来,球形棕囊藻在我国频繁引发赤潮。球形棕囊藻引发的赤潮有时会产生溶血毒素。赤潮藻合成毒素可能是藻细胞个体生存受到限制时引发的一种化感行为。影响球形棕囊藻毒素生物合成的因素及其生物合成机制十分复杂。
为了提取球形棕囊藻合成的溶血毒素,本实验对球形棕囊藻破壁条件进行了优化,用超声波破壁时,超声波的功率和处理时间越长,破碎效果越好。考虑到超声波设备的使用寿命及破壁时产生的高温可能对溶血毒素活性的负面影响,球形棕囊藻细胞壁的超声波破碎最适条件为:功率600W,4℃下处理30min,对数生长期、平稳期和衰亡期藻细胞适宜处理量分别为每次3000、2000、1000mL。
实验室培养的球形棕囊藻合成的毒素与野生球形棕囊藻的毒素的活性相似,其活性约为21HU/L。用薄层色谱对该溶血毒素的组分进行分析发现实验室培养的球形棕囊藻合成的毒素与野生球形棕囊藻的毒素组分稍有差别,实验室培养的球形棕囊藻合成的毒素至少含有4种糖脂类物质。
球形棕囊藻溶血毒素对血红细胞的的破坏作用是首先作用于其细胞膜,毒素的疏水基团与血红细胞膜表面的膜脂连接,产生脂溶效应使细胞膜破坏。在不同的温度、H+浓度和二价阳离子条件下,球形棕囊藻溶血毒素溶血活性不同。温度越高,其活性越强,37℃为最适反应温度;而环境pH值条件下(pH=7)时,球形棕囊藻溶血毒素的活性最强;二价阳离子中,Hg2+对溶血毒素溶血活性的抑制作用最强,Mn2+,Ca2+,Co2+和Zn2+产生的影响较小。当Hg2+存在时该毒素甚至不能产生溶血活性。EDTA能完全消除Hg2+的溶血抑制作用。Hg2+及其它二价阳离子的抑制作用的产生可能是它们关闭了溶血反应通道;膜脂的存在其溶血活性也发生改变,其中卵磷脂、鞘磷脂、神经节苷脂和胆固醇等对溶血活性均可产生显著的抑制作用,其中以鞘磷脂的抑制作用最大;磷脂酸对该溶血毒素的溶血反应几乎没有抑制作用。不同膜脂的抑制作用显示毒素在细胞膜上可能没有特异的膜受体。
球形棕囊藻溶血毒素对东海原甲藻、海洋褐孢藻、卵状褐孢藻及卤虫的生长具有一定的抑制和(或)杀灭作用;共培养时,球形棕囊藻对其它
三种藻生长的影响弱于毒素的直接作用,但强于无细胞过滤液的作用。显微镜下观察发现,球形棕囊藻溶血毒素对海洋褐孢藻的破坏过程与其对兔血红细胞的作用类似,是先破坏其细胞膜,细胞内容物外泄导致细胞死亡。毒素的产生可能是抑制或清除其它藻类竞争者的一种策略,即化感作用。
实验室培养球形棕囊藻不同生长期和不同的营养条件下其溶血活性明显不同。批量培养时,溶血毒素的生物合成在平稳期和衰亡期的能力增强,培养至第12天时其溶血活性达21±1HU/L;半连续培养时,5种营养盐条件下球形棕囊藻溶血毒素的合成能力都明显地增强,其中Fe3+和N盐的限制可促进其溶血毒素的合成,而P盐限制对毒素的合成能力有轻微的抑制作用。培养末期5种营养盐条件下球形棕囊藻溶血毒素的活性分别为:N限制:169.3HU/L,Fe3+限制:178.3HU/L,对照:127.1HU/L,Mn2+限制:127.6HU/L和P限制:87.5HU/L。
根据两个生长时期球形棕囊藻合成的溶血毒素的差异,首次应用了将抑制消减杂交(SSH)技术进行藻类差异表达基因的筛选。建立了一种新的藻类总RNA提取方法,并根据不同生长时期球形棕囊藻细胞合成溶血毒素的差异,完成了球形棕囊藻对数生长时期和平稳期细胞的基因差减文库的构建,并筛选出了1个可能与产毒相关的基因cDNA片段。该片段在Genbank里检索未发现有同源序列,提示其可能来自于新基因。