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捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）,又称捻转胃虫,主要寄生于反刍动物的皱胃,偶见于小肠。该虫体是一种具有高度致病性的吸血性线虫,引起大龄动物贫血、厌食、皮毛粗乱和产奶量下降,严重的则可导致幼龄动物以及妊娠动物的死亡。该虫体严重危害了畜牧业的生产,加上它严重的耐药性与药物残留,使得对于虫体的防控,越显得挑战性。近些年来,关于捻转血矛线虫的免疫与致病机理的研究越来越受到国内外研究人员的关注。最近研究发现,谷氧还蛋白结构域包含蛋白（Grx-1）、转录因子E2F二聚体伴侣蛋白结构域包含蛋白（DP-1）、巴豆酸酶（烯酰水合酶）结构域包含蛋白（Crt-1）、芳香族氨基酸β-消除裂合酶（苏氨酸醛缩酶）结构域包含蛋白（TA-1）和线粒体Rho GTP酶结构域包含蛋白（Miro-1）,这5种捻转血矛线虫的排泄分泌蛋白,体内能够与山羊外周血单个核细胞（PBMC）结合。然而,到目前为止,有关这5种蛋白对山羊PBMC的功能影响还不清楚,因此,本文选取了这5种蛋白进行体外对山羊PBMC刺激功能影响的研究。1捻转血矛线虫Grx-1、DP-1、Crt-1、TA-1和Miro-1基因的克隆与序列分析采用捻转血矛线虫的总RNA作为RT-PCR的模板,以设计的特异性引物进行PCR反应,分别得到捻转血矛线虫谷氧还蛋白结构域包含蛋白基因（Grx-1,GenBank登录号:HCOI01871900）、转录因子E2F二聚体伴侣蛋白结构域包含蛋白基因（DP-1,GenBank登录号:HCOI01892600）、巴豆酸酶（烯酰水合酶）结构域包含蛋白基因（Crt-1,GenBank登录号:HCOI01053700）、芳香族氨基酸β-消除裂合酶（苏氨酸醛缩酶）结构域包含蛋白基因（TA-1,GenBank登录号:HCOI01467900）和线粒体Rho GTP酶结构域包含蛋白基因（Miro-1,GenBank登录号:HCOI02135300）。扩增产物进行凝胶回收与纯化后,连接到克隆载体pMD-19T上。单克隆菌落分别双酶切鉴定,然后选择阳性克隆的质粒进行序列测定与分析。结果表明,Grx-1基因的ORF含有672bp,编码含有223个氨基酸的蛋白质,理论相对分子量为26.313 kDa,理论等电点为8.77;该序列与GenBank中捻转血矛线虫Grx-1基因同源性为100%。DP-1基因的ORF含有1851bp,编码含有616个氨基酸的蛋白质,理论相对分子量为68.288 kDa,理论等电点为9.28;该序列与GenBank中捻转血矛线虫DP-1基因同源性为98%。Crt-1基因的ORF含有777bp,编码含有258个氨基酸的蛋白质,理论相对分子量为28.873 kDa,理论等电点为6.9;该序列与GenBank中捻转血矛线虫Crt-1基因同源性为98%。TA-1基因的ORF含有1194bp,编码含有397个氨基酸的蛋白质,理论相对分子量为43.818 kDa,理论等电点为7.9;该序列与GenBank中捻转血矛线虫TA-1基因同源性为95%。Miro-1基因的ORF含有894bp,编码297个的氨基酸,理论相对分子量为33.689 kDa,理论等电点为6.68;该序列与GenBank中捻转血矛线虫Miro-1基因同源性为97%。进化树分析表明,这几种蛋白的氨基酸序列与GenBank中板口线虫属、胎生网尾线虫、十二指肠钩口线虫的相应蛋白的氨基酸序列都具有较高的相似性。2捻转血矛线虫Grx-1、DP-1、Crt-1、TA-1和Miro-1的原核表达获得的目的片段再亚克隆到表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET-32a/Grx-1、pET-32a/DP-1、pET-32a/Crt-1、pET-32a/TA-1 和 pET-32a/Miro-1。重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中后用IPTG进行诱导表达,并用镍柱纯化重组蛋白。纯化后的包涵体蛋白依次用浓度梯度递减的尿素溶液进行连续透析复性。所得蛋白免疫大鼠获得抗血清。结果显示构建成功的5种重组质粒均可在大肠杆菌BL21中表达。5 种重组蛋白 rGrx-1（46kDa）、rDP-1（88kDa）、rCrt-1（49 kDa）、rTA-1（64kDa）和rMiro-1（54kDa）主要在包涵体中表达,且纯化效果较好。Western blot显示,rGrx-1、rDP-1、rCrt-1、rTA-1和rMiro-1 5种重组蛋白,均能被人工感染捻转血矛线虫的山羊血清所识别,表明该5种重组蛋白免疫原性较好,刺激宿主机体后都能产生相应的抗体。3 rGrx-1、rDP-1、rCrt-1、rTA-1 和 rMiro-1 与山羊 PBMC 的结合试验分别将山羊 PBMC 与 10 μg/mL 的重组蛋白 rGrx-1/rDP-1/rCrt-1/rTA-1/rMiro-1 共孵育,采用间接免疫荧光抗体技术观察这5种重组蛋白与山羊PBMC的结合情况。实验结果证明,这5种重组蛋白体外都能够与山羊PBMC结合。4 rGrx-1、rDP-1、rCrt-1、rTA-1和rMiro-1对山羊PBMC细胞因子表达的影响用不同浓度的重组蛋白（0,10,20和40 μg/mL）分别刺激山羊PBMC 24 h后,重悬并收集细胞进行RNA的提取,采用荧光定量PCR技术检测各组细胞中IL-2、IFN-γ、IL-4、1L-17、IL-10和TGF-β等细胞因子基因的转录水平变化。结果显示,5种蛋白分别刺激山羊PBMC后,40 μg/mL rGrx-1显著刺激TGF-β的表达,极显著抑制IL-4和IFN-γ的表达;10与20 μg/mL rDP-1显著刺激IL-4和TGF-β的表达;10与20 μg/mL rCrt-1显著刺激IL-4的表达,20 μg/mL显著抑制IL-10的表达,20与40 μg/mL显著抑制IL-17的表达,40 μg/mL显著抑制IL-2的表达;20 μg/mL rTA-1极显著刺激IL-4、IL-2、IFN-γ的表达,各种浓度的rTA-1均极显著促进IL-17的表达;10与40 μg/mL rMiro-1极显著促进IL-17的表达,20与40 μg/mL极显著促进IL-4的表达,40 μg/mL极显著刺激IL-2的表达。5rGrx-1、rDP-1、rCrt-1、rTA-1和rMiro-1对山羊PBMC细胞增殖和迁移的影响用不同浓度的5种重组蛋白（0,10,20和40 μg/mL）分别刺激山羊PBMC,刺激72 h后采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况;刺激24 h后收集细胞,采用迁移小室研究细胞迁移影响。试验结果表明与细胞对照组相比,40 μg/mLrGrx-1极显著抑制细胞增殖和迁移,10 μg/mL rDP-1极显著促进细胞增殖和迁移,20 μg/mL rTA-1极显著促进细胞增殖和迁移,rMiro-1以剂量依赖性方式促进细胞的增殖和迁移;对于rCrt-1,低浓度时可增强细胞的迁移能力,但高剂量却降低了细胞迁移,各种浓度对细胞增殖均没有显著影响。6 rGrx-1、rDP-1、rCrt-1、rTA-1和rMiro-1对山羊PBMC NO的释放和单核细胞吞噬能力的影响用不同浓度的5种重组蛋白（0,10,20和40 μg/mL）分别刺激山羊PBMC/单核细胞,24 h后采用总一氧化氮试剂盒检测细胞NO释放情况;48 h后收集细胞,用流式细胞仪检测单核细胞吞噬FITC-dextran的能力。结果表明,与细胞对照组相比,20与40 μg/mL rGrx-1极显著抑制NO的释放和单核细胞的吞噬作用;而rDP-1和rCrt-1对NO的释放或单核细胞的吞噬能力均没有显著的影响;各种浓度的rTA-1均显著促进NO的释放,20 μg/mL极显著促进NO的释放,40 μg/mL对单核细胞的吞噬功能表现极显著的促进作用;20与40 μg/mL rMiro-1极显著促进NO的释放,40 μg/mL对单核细胞的吞噬功能表现极显著的促进作用。