论文部分内容阅读
目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种严重危害人类生命和健康常见疾病,目前已成为发达国家人口死亡的主要原因之一。AS是由于各种刺激因素作用于动脉血管壁引起的炎症性疾病,是心脑血管病的主要诱因。然而AS在体内的具体发生过程及原因还没有清楚地解释,因此探讨其具体发病机制对心血管疾病的防治和人类的身体健康有重大意义。动脉粥样硬化的发生发展过程与血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)功能的改变密切相关。VSMCs可以通过调节介质如血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor,PDGF)刺激从血管壁的中向内膜迁移,这一改变是动脉粥样硬化斑块形成的重要步骤之一。Rho激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白酶家族,在VSMCs的迁移和增殖过程中发挥重要作用,其机制主要是通过调控微丝骨架组装和细胞的局部连接。然而,ROCK对AS发生过程中血管重构的调节机制尚未完全明确。以往研究已经证实,微小RNA(miRNA)与AS的发生有密不可分的联系。本研究拟通过培养人主动脉血管平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells,AoSMCs),大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)和大鼠原代胸主动脉细胞来探索miRNAs对ROCK调控的血管平滑肌细胞增殖迁移的影响及机制。方法:(1)使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)检测利用ROCK的抑制剂Y27632处理A7r5后mi RNA-92a的变化;(2)利用si RNA干扰技术,通过脂质体转染ROCK/siRNA(siROCK),运用qPCR检测ROCK mRNA水平基因表达是否成功下调;(3)使用瞬时转染技术转染miR-92a模拟物(Pre-miR-92a)和抑制剂(AntimiR-92a),在VSMCs中抑制或过表达,运用qPCR检测miR-92a是否成功上调或下调;(4)利用siRNA干扰技术,对miR-92a进行上调和下调后qPCR检测ROCK mRNA的表达水平变化;(5)分别采用Boyden Chamber和CCK-8检测miR-92a和ROCK对VSMCs迁移和增殖的影响;(6)利用CCK-8及Boyden Chamber方法检测miR-92a靶基因哺乳动物转录因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)对VSMCs增殖和迁移的影响;(7)运用Western blot检测ROCK的抑制剂Y27632处理VSMCs后KLF4的表达情况;(8)运用细胞免疫荧光技术分析miR-92a和ROCK对VSMCs细胞伪足伸出情况和KLF4表达情况。结果:(1)ROCK抑制剂Y27632使miR-92a的表达下调;(2)mi R-92a的模拟物和抑制剂对ROCK的表达量无明显影响;(3)Anti-miR-92a可抑制由PDGF诱导的A7r5细胞的增殖和迁移,而Pre-miR-92a可以促进A7r5细胞的增殖与迁移;(4)ROCK抑制剂Y27632可以抑制由PDGF诱导的A7r5细胞的增殖和迁移;(5)Pre-miR-92a可以恢复Y27632对VSMCs增殖和迁移的抑制作用;(6)KLF4可以抑制VSMCs的增殖和迁移;(7)Y27632使A7r5细胞中KLF4表达量增加;(8)在PDGF-BB刺激下,anti-miR-92a使KLF4表达量升高,并且抑制丝状伪足形成。siROCK也可使KLF4表达量升高,抑制丝状伪足形成;而pre-miR-92a可以部分抵消siROCK后的上述现象。结论:(1)ROCK和miR-92a均可以促进VSMCs的增殖和迁移;(2)ROCK通过调控miR-92a促进VSMCs的增殖和迁移;(3)ROCK通过miR-92a进而作用于KLF4,以调控PDGF-BB介导的VSMC增殖和迁移。