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水稻(Oryza sativa L.)是一种主要的粮食作物,全世界大部分的人都以水稻为主食,因此,水稻的产量直接对世界性的粮食安全起着至关重要的作用。水稻产量的95%归功于叶片的光合作用,所以叶片的发育情况将会严重影响水稻产量和品质,而叶片发育情况最直观的表现就是叶色。不仅如此,水稻的产量和株型会受到株高这一重要农艺性状的直接影响。水稻抽穗期也是影响水稻产量的重要的农艺性状之一,受感光性、感温性和基本营养生长性的影响,三者共同决定着一个品种对地区与季节的适应能力。因此,发掘影响水稻叶色、株高、抽穗期相关的基因对于指导优良品种的选育具有重大的意义。
本研究基于实验室前期已经获得的黄化矮杆早熟表型可稳定遗传的水稻突变体lt9为试验材料,通过表型观察和数据统计对其进行成熟期的表型分析和突变体的遗传分析;构建突变体lt9与MH63杂交的F2代群体,通过图位克隆技术定位到基因OsHY2,并对其进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR实验,探究OsHY2基因的表达模式;构建OsHY2超量表达载体,获取过表达水稻转基因株系。为探究基因OsHY2突变在植株出现黄化、矮杆、早熟等一系列的表型变化中的作用,初步解析OsHY2在水稻叶色、株高、抽穗期中的调节功能,为水稻生育期改良提供关键信息和理论支持,对水稻育种实践和生产具有重要的指导意义。取得的主要研究结果如下:
(1)突变体lt9的表型分析。在长短日照两种生长环境下,与野生型相比,突变体lt9表现出叶片黄化、株高变矮、抽穗期提前的表型。统计分析重要农艺性状发现,短日照生长环境下,lt9的结实率下降,育性显著降低。
(2)突变体Oslt9的基因克隆。野生型与突变体杂交的F1代植株的表型均为正常表型;F2代植株发生叶色分离,比值接近于3:1,卡方检测结果进一步说明突变体lt9的遗传方式为单基因隐性遗传。利用突变体与MH63(明恢63)构建定位群体进行目的基因的定位与图位克隆,将Oslt9定位于水稻第1号染色体Indel标记M41-1和M41-2之间,物理距离为122.3kb的范围内。通过测序分析,发现只有一个基因OsHY2(LOC_Os01g72090)发生了突变,其编码区的一个核苷酸G突变为T,使谷氨酸突变为终止密码子。生物信息学分析表明,该基因可能与光响应和激素间的相互作用有关;该基因编码的蛋白为亲水性蛋白,由301个氨基酸组成,且含有多个潜在磷酸化位点,其中以丝氨酸种类的置信度较高且数目较多;本研究中该基因发生突变的核苷酸对应的氨基酸在拟南芥、玉米、高粱中表现较高的保守性,意味着该蛋白在突变体lt9中基本丧失了功能。
(3)水稻OsHY2基因的表达特性分析。荧光定量PCR检测结果显示,OsHY2主要在叶中表达,不同时间点的表达量存在差异;在长日照生长环境下,叶绿素合成途径相关基因表达量升高,OsHY1与OsHEMA1表达量也升高,叶绿素代谢相关基因表达量降低,检测长短日照两种环境下成花素基因Hd3a和RFT1的表达,发现两者在突变体中表达均上调,而且长日照环境下,同一成花素基因在野生型和突变体中的表达量差异更显著,结果进一步说明长日照突变体的抽穗期显著提前是由OsHY2基因突变引起。
(4)OsHY2基因超量载体的构建及对水稻的遗传转化。构建出OsHY2超表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法侵染水稻(ZH11),进行培育筛选以获取OsHY2水稻过表达转基因植株,目前已获得转基因愈伤组织,正在进行分化培养。水稻中OsHY2基因对光周期的调节机制尚不透彻,其过表达转基因植株的获取有利于开展该基因在调控水稻早期生长发育、对逆境胁迫的耐受性以及激素相关的进一步研究,且有助于为光周期不敏感水稻品种的选育提供重要的参考信息。
本研究基于实验室前期已经获得的黄化矮杆早熟表型可稳定遗传的水稻突变体lt9为试验材料,通过表型观察和数据统计对其进行成熟期的表型分析和突变体的遗传分析;构建突变体lt9与MH63杂交的F2代群体,通过图位克隆技术定位到基因OsHY2,并对其进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR实验,探究OsHY2基因的表达模式;构建OsHY2超量表达载体,获取过表达水稻转基因株系。为探究基因OsHY2突变在植株出现黄化、矮杆、早熟等一系列的表型变化中的作用,初步解析OsHY2在水稻叶色、株高、抽穗期中的调节功能,为水稻生育期改良提供关键信息和理论支持,对水稻育种实践和生产具有重要的指导意义。取得的主要研究结果如下:
(1)突变体lt9的表型分析。在长短日照两种生长环境下,与野生型相比,突变体lt9表现出叶片黄化、株高变矮、抽穗期提前的表型。统计分析重要农艺性状发现,短日照生长环境下,lt9的结实率下降,育性显著降低。
(2)突变体Oslt9的基因克隆。野生型与突变体杂交的F1代植株的表型均为正常表型;F2代植株发生叶色分离,比值接近于3:1,卡方检测结果进一步说明突变体lt9的遗传方式为单基因隐性遗传。利用突变体与MH63(明恢63)构建定位群体进行目的基因的定位与图位克隆,将Oslt9定位于水稻第1号染色体Indel标记M41-1和M41-2之间,物理距离为122.3kb的范围内。通过测序分析,发现只有一个基因OsHY2(LOC_Os01g72090)发生了突变,其编码区的一个核苷酸G突变为T,使谷氨酸突变为终止密码子。生物信息学分析表明,该基因可能与光响应和激素间的相互作用有关;该基因编码的蛋白为亲水性蛋白,由301个氨基酸组成,且含有多个潜在磷酸化位点,其中以丝氨酸种类的置信度较高且数目较多;本研究中该基因发生突变的核苷酸对应的氨基酸在拟南芥、玉米、高粱中表现较高的保守性,意味着该蛋白在突变体lt9中基本丧失了功能。
(3)水稻OsHY2基因的表达特性分析。荧光定量PCR检测结果显示,OsHY2主要在叶中表达,不同时间点的表达量存在差异;在长日照生长环境下,叶绿素合成途径相关基因表达量升高,OsHY1与OsHEMA1表达量也升高,叶绿素代谢相关基因表达量降低,检测长短日照两种环境下成花素基因Hd3a和RFT1的表达,发现两者在突变体中表达均上调,而且长日照环境下,同一成花素基因在野生型和突变体中的表达量差异更显著,结果进一步说明长日照突变体的抽穗期显著提前是由OsHY2基因突变引起。
(4)OsHY2基因超量载体的构建及对水稻的遗传转化。构建出OsHY2超表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法侵染水稻(ZH11),进行培育筛选以获取OsHY2水稻过表达转基因植株,目前已获得转基因愈伤组织,正在进行分化培养。水稻中OsHY2基因对光周期的调节机制尚不透彻,其过表达转基因植株的获取有利于开展该基因在调控水稻早期生长发育、对逆境胁迫的耐受性以及激素相关的进一步研究,且有助于为光周期不敏感水稻品种的选育提供重要的参考信息。