1型、2型糖尿病及妊娠期糖尿病(Gestationaldiabetesmellitus,GDM)在全球范围内流行,过去20年间,患病率逐渐增加,尤其是在中国。我国已经成为世界上发病率最高的国家之一。GDM是妊娠期间首次发现的葡萄糖不耐受的状态,给母亲、胎儿及新生儿带来近远期并发症,包括巨大儿、羊水过多、并发子痫前期、新生儿低血糖、新生儿高胰岛素血症等,随之而来的肩难产、剖宫产、产伤、产后出血等危险性显著增加。孕期发生GDM,产后及子代未来发生2型糖尿病(Type 2diabetesmellitus,T2DM)的风险显著增加,并且发病呈年轻化趋势。若为女性子代,将来罹患GDM的风险又大大升高。如此循环往复,给我国人口素质带来严重的恶性影响。因此,如何从源头上遏制GDM发生,是我们首要的研究目的。目前GDM病因未明,近年来的研究显示,妊娠期的激素水平、自身免疫、遗传、脂肪细胞因子水平、炎症因子水平的变化,都或多或少加重了 GDM患者的胰岛素抵抗状态,在GDM的发病或病情进展中发挥了作用,但上述所有致病因素尚不能完全解释GDM的发病机制以及对胎儿近远期不良影响的作用环节因此也无法从源头上加以预测和预防。胎盘是女性在妊娠期间产生的一个临时性的、但极其重要的器官,它是母体与胎儿之间唯一的沟通渠道。母体具备健康的生理环境,才能促使胎盘正常地生长、发育、成熟,从而保证其正常地行使代谢功能,完成营养物质以及气体的输送,保护胎儿逃逸母体的免疫系统,确保胎儿的生长发育。然而,胎盘又是一个分泌器官,其合成的各类蛋白和丰富的激素反馈作用于母体,引起母体局部或系统性的改变,以维持妊娠过程顺利进行。GDM患者的胎盘形态上较正常孕妇的胎盘体积更大,且质地脆、易碎。显微镜下可见50-60%的绒毛发育不成熟,绒毛直径扩大、水肿,合体细胞结节增多,干绒毛小动脉管壁增厚,管腔狭窄,纤维蛋白样坏死增多等表现。同时合体滋养细胞的超微结构会发生显著的变化:游离面的绒毛短小、稀疏,线粒体肿胀,粗面内质网扩张,基底膜弯曲增厚。即使GDM孕妇孕期血糖控制良好,胎盘的这种形态和组织学上的改变并不能够被改善。因此,研究胎盘病理生理以及其表达的基因、合成的蛋白质是从源头控制GDM的切入点。人类PLAC1(Placenta-specific1)蛋白仅在在胎盘的滋养细胞上表达。含有212个氨基酸的蛋白质,分子量约为28-30KDa,结构上有一段高度保守的信号序列,4个糖基化位点和13个潜在的磷酸化位点,推测在调节机体糖代谢和维持正常妊娠中起至关键作用。我们假设PLAC1表达改变引起能量代谢异常,从而导致了 GDM的发生和/或发展。拟从整体水平上检测GDM孕妇和正常孕妇的胎盘内PLAC1蛋白的表达量变化及其在胎盘内的定位,并结合临床资料分析PLAC1蛋白变化与GDM相关性。同时,从细胞水平探讨PLAC1蛋白变化对滋养细胞功能的影响;并建立高糖细胞模型,探讨PLAC1与瘦素(Leptin)之间的调控关系,以及两者与GDM的胰岛素抵抗发生发展的关系。从而能更深入的研究妊娠期糖尿病的发病机制,为筛选高特异性和灵敏性的生物指标提供依据,以期能早期预测妊娠期糖尿病的发生和发展,改善母儿结局。第一部分妊娠期糖尿病孕妇PLAC1的表达及潜在临床意义研究目的:观察PLAC1在妊娠期糖尿病(GDM)胎盘组织中的表达和定位,分析其与GDM孕妇临床指标之间的相关性。方法:选取在我院定期产检并行剖宫产手术分娩的孕妇共75例,其中37例孕妇被诊断为GDM,38例为正常对照。收集入组病例的相关临床资料并整理信息,收集入组孕妇的空腹血液及胎盘组织。采用糖氧化酶比色法测定空腹血糖(FPG),采用化学发光法和酶测定法测定糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定空腹胰岛素(Fins)。采用Western blot及免疫组织化学技术测定胎盘组织内的PLAC1表达量及分布。并分析PLAC1的表达量与临床资料及血液指标的相关性。结果:1.GDM 组孕妇的 FPG 为 3.98±0.98 mmol/L、HbA1c 为 5.44±0.60%、OGTT Oh为 5.29±1.11 mmol/L、OGTT 1h 为 10.84±2.58 mmol/L、OGTT 2h 为 8.89±1.72 mmol/L、新生儿的出生体重为3606.76±445.06g均显著高于对照组,分别为3.58±0.65mmol/L、5.08±0.41%、4.48±0.26 mmol/L、8.19±1.17mmol/L、6.62±0.91 mmol/L、3404.47±337.52g,(p<0.05)。2.GDM孕妇胎盘内的PLAC1的表达量(1.08±0.64)低于正常对照的胎盘PLAC1的表达量(1.75±1.28),且差异具有显著性(p<0.01)。3.正常妊娠情况下PLAC1蛋白与分娩时BMI、Fins、TG及HOMA-IR呈正相关,在GDM情况下却与这些指标无相关关系。4.胎盘组织免疫组织化学技术检查结果:GDM孕妇胎盘,不成熟绒毛均较多见,细胞滋养细胞增多,小血管管腔明显狭窄,合体细胞结节明显增多,纤维蛋白样坏死的绒毛增多。PLAC1蛋白在胎盘组织内呈棕色强阳性表达,并且表达主要分布在绒毛间质及合体滋养细胞的胞质内。对照组胎盘胎儿面及母体面的PLAC1蛋白表达水平明显高于GDM组。结论:PLAC1蛋白在胎盘内主要表达在合体滋养细胞的胞质内和绒毛间质细胞胞质内,同时在GDM胎盘内表达显著下降,正常妊娠情况下其与分娩时BMI、Fins、TG及HOMA-IR呈正相关,在GDM情况下却与这些指标无相关关系,说明PL AC 1与调节体内代谢活动关系密切,同时提示GDM的发生、发展与胎盘内PLAC1蛋白含量减少相关。第二部分PLAC1对滋养细胞生物学行为的影响研究目的:明确PLAC1对滋养细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的调控作用。方法:利用细胞转染技术,在滋养细胞系SWAN及JAR中转染PLAC1小干扰序列下调PLAC1的表达,或在上述两种细胞系中转染PLAC1质粒上调PLAC1的表达,分别通过CCK-8法检查滋养细胞的增殖能力,Transwell联合或不联合matrigel基质胶来检测滋养细胞的侵袭和迁移能力。Western blot法检测PLAC1蛋白水平。结果:1.SWAN细胞干扰效率为62%,JAR细胞干扰效率为58%。SWAN细胞上调效率为159%,JAR细胞上调效率为278%。均具有显著差异2.在滋养细胞系里,下调PLAC1的表达可以明显抑制SWAN及JAR细胞的增殖、侵袭和迁移能力。3.在滋养细胞系里,上调PLAC1的表达可以显著促进SWAN及JAR细胞的增殖、侵袭和迁移能力。结论:PLAC1低表达可以明显抑制滋养细胞的增殖、侵袭、迁移的能力,提示PLAC1表达降低可以引起滋养细胞功能异常,影响胎盘的正常生长发育,进一步影响母体GDM和其他妊娠期并发症的发生和发展。第三部分滋养细胞高糖培养下PLAC1的变化及其与Leptin之间的相关研究研究目的:通过高糖培养滋养细胞来模拟人体内血糖变化的环境,从而研究不同的血糖水平下PLAC1的变化情况。以及了解PLAC1与引起GDM相关因子Leptin之间的关系。方法:用两种不同糖浓度的培养基以及甘露醇高渗培养基分别培养滋养细胞系SWAN及JAR细胞。利用细胞转染技术,在滋养细胞系SWAN及JAR中转染PLAC1小干扰序列下调PLAC1的表达,来观察上述两种细胞内及细胞培养上清内Leptin的水平变化。同时,在上述两种细胞系中转染PLAC1质粒上调PLAC1的表达,来观察上述两种细胞内Leptin的表达。Western blot法检测细胞内PLAC1及Leptin蛋白水平。Elisa法检测细胞培养上清内Leptin蛋白水平。结果:1.高糖培养下的滋养细胞内PLAC1的表达显著下降,Leptin的表达及分泌到培养上清内的Leptin显著增加2.在滋养细胞系里,下调PLAC1的表达后,Leptin的合成及分泌显著增加。3.在滋养细胞系里,上调PLAC1的表达后,Leptin的表达显著降低。结论:PLAC1的表达可受到高糖环境刺激而下降,同时PLAC1水平降低可导致Leptin的合成和分泌增加,PLAC1水平上升,可导致Leptin的合成和分泌减少。PLAC1对Leptin的调控作用可能导致了 GDM的发生发展。