免疫反应分为两个分支,先天性免疫和获得性免疫,昆虫不具备哺乳动物那样完善的获得性免疫系统,因此先天免疫就成为了其抵抗病原微生物入侵的主要手段,而昆虫的先天免疫又分为细胞免疫和体液免疫两大部分,二者共同作用抵御病原物的侵染。细胞免疫包括吞噬、集结和包囊等作用类型,同时体液免疫主要包括黑色素形成和抗菌肽产生两种机制。柞蚕是一种重要的野生绢丝昆虫,主要分布区域分别在亚洲国家,具有可以作为纺织工业原料利用的价值,而且具备很高的药用和食用经济价值,因此,对柞蚕先天免疫防御相关基因的研究对于提高柞蚕抗病能力具有重要的理论意义,此外,也可以推进鳞翅目其他昆虫相关研究,从而进一步为鳞翅目病虫害的防治提供借鉴。利用分子生物学和生物信息学方法对柞蚕defense基因进行分析研究,得到的主要研究成果有以下几点:1.ApDef基因的克隆及序列分析:通过实验克隆出ApDef基因的cDNA序列,总长677bp,包括编码163个氨基酸的开放阅读框(ORF),以及5’端非编码区(5’UTR)和3’端非编码区(3’UTR)分别为63bp和122bp。预测蛋白分子量约为17 kDa,理论等电点为4.74;该蛋白属于亲水性蛋白,有明显的信号肽,没有明显的跨膜结构域,且亚细胞定位在线粒体或其它部位的可能性很小,位于胞外的可能性最大。构建的系统进化树显示柞蚕与天蚕亲缘关系最近,与哺乳动物人和小鼠的距离较远。2.ApDef基因的表达分析:提取柞蚕五龄时期不同组织总RNA,设计特异性引物,进行了实时荧光定量PCR(QRT-PCR)。实验结果显示,选取的组织表达量有明显差异,在脂肪体中表达量最高,血细胞和中肠中有微量表达,表皮中不表达。PCR扩增柞蚕ApDef基因的ORF,连接到pET-28a(+)表达载体,并且转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,用IPTG进行了不同浓度的诱导表达,用SDS-PAGE电泳和Western blot方法检测验证,表明被诱导的目的蛋白均得到了稳定的表达。用IPTG进行了重组蛋白大量诱导并纯化,制备单克隆抗体。用大肠杆菌,藤黄微球菌和白僵菌处理五龄期柞蚕,提取其不同时间段不同处理方式的柞蚕脂肪体RNA,反转录cDNA,设计特异性引物,进行了实时荧光定量PCR(QRT-PCR)。实验结果显示,ApDef的表达水平与对照相比显著上调,而且在感染12小时后达到最大。这些数据表明,ApDef可能在柞蚕的先天免疫应答中起重要作用。