knk是昆虫几丁质排布过程的一个重要基因。在果蝇中突变knk研究表明:胚胎时期影响表皮原表皮层几丁质的形成,在气管系统中影响气管内几丁质的排列,z最终在幼虫早期致死。但关于knk对果蝇重要组织器官翅和平衡棒发育影响的研究还未见报道。Gal4/UAS系统是果蝇中常用的转基因表达调控工具,可实现启动子特性控制下靶基因的特异表达。本研究首先系统地研究了Gal4/UAS系统随温度因子对靶基因表达水平的调节规律,充分利用该调节系统,研究过表达和RNA干扰knk对果蝇附属功能器官——翅和平衡棒形成的调控机制。主要内容如下:一、Gal4/UAS系统随温度对靶基因表达水平的调节规律以dpp-Gal4和靶基因wg为例,通过设置不同温度培养杂交子代,对三龄幼虫翅芽进行荧光免疫组化的系列实验。结果表明,转基因wg过表达水平不受温度影响,RNA干扰wg时表达水平随温度升高而降低。将温控因子Gal80ts与Gal4重组后驱动靶基因,可在25~30℃之间的温度实现对靶基因表达水平的灵活调控。二、knk表达特性及调控knk表达水平对翅发育的影响采用RT-qPCR检测knk在果蝇中的表达特性,结果显示knk在果蝇蛹期后高表达。借助Gal80ts和温度调节探索得出knk在翅上作用时间约从化蛹前30 h到蛹后48 h。利用Gal4/UAS系统中靶基因表达受温度影响的规律,在整个翅上特异性过表达和干扰knk。幼虫期均无任何表型,蛹期和成虫翅过表达knk均无可见表型,而干扰knk后蛹期翅受力时在蛹中伸展(不可恢复),难以展平,成虫期出现三种缺陷型表型:1)虫体无法羽化而致死;2)虫体断翅羽化,翅残留在蛹壳内;3)虫体带有缺陷翅羽化,翅皱缩或颜色变浅。使用ap-Gal4仅在dorsal层过表达knk后,翅向上翘,而干扰knk后,翅向下翘。三、调控knk表达水平对果蝇翅结构和性质的影响进一步检测表明,过表达和干扰knk后均可影响翅的物理结构和某些性质。过表达knk时,蛹期翅两层间隙变宽,整体变厚;成虫翅翅脉颜色略深,对FB28染料不渗透,翅膜纳米级结构分叉,而几丁质片层,脂质分布区域无明显变化。干扰knk后蛹期翅间隙变窄,翅整体变薄。成虫翅翅脉结构受损,翅膜刚毛凸显,FB28染料易渗透至翅膜,翅膜纳米级结构突包变小变矮,脂质分布区域改变,原表皮变薄,几丁质片层消失。四、调控knk对果蝇平衡棒的影响平衡棒是双翅目昆虫中后翅退化的结构,其大小在雌雄之间本身存在差异,过表达knk后,平衡棒大小无明显变化,而干扰后,雌雄个体的平衡棒均变小,雌虫变小的程度比雄虫更明显。平衡棒表层的透射电镜结果表明:干扰knk后,几丁质片层消失。结论:Gal4/UAS系统可随温度因子对靶基因表达水平进行灵活调节;knk对果蝇翅形成的影响表现在:影响虫体羽化,几丁质片层结构形成,翅膜表面纳米级结构,进而影响其对部分染料的渗透性和脂质区域化;同时对平衡棒的大小有一定影响。该研究将补充和深化昆虫翅和平衡棒,knk基因功能以及几丁质形成等研究领域的内容。