研究目的转录后基因调控对于编码或非编码核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)的成熟、转运、稳定性及翻译均具有举足轻重的作用,RNA结合蛋白是其中的核心调控元件。钙调磷酸酶调节因子1(Regulatorofcalcineurin 1,RCAN1)已被证实在神经元退行性病变、线粒体功能障碍、炎症及蛋白糖基化等过程中均发挥重要作用,尤其是唐氏综合征(Down syndrome,DS)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)的重要致病原因之一。目前RCAN1基因可检测到3个转录本,转录本1起始于1号外显子(RCAN1.1mRNA),可翻译出两条长短不一的蛋白,较长的含有252个氨基酸的蛋白命名为RCAN1.1L,较短的含有197个氨基酸的蛋白命名为RCAN1.1S。我们之前的研究结果发现RCAN1可增加腺嘌呤核苷酸转运体1信使 RNA(Adenine nucleotide translocator messenger RNA,ANT1 mRNA)的稳定性,从而使ANT1蛋白表达升高并导致线粒体功能紊乱,神经元凋亡增加,然而其中RCAN1对ANT1 mRNA发挥作用的机制却仍待阐释。在本研究中,我们从解读RCAN1蛋白与ANT1 mRNA之间的相互作用机制开始,从多方面首次证明RCAN1蛋白是一种RNA结合蛋白,并寻找其与ANT1 mRNA的具体结合位点,筛选与RCAN1蛋白具有高亲和力的RNA适配体并深入研究该RNA适配体对RCAN1蛋白功能的影响。每年在世界范围内急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)威胁到上千万人的生命健康,近年来在全球致死致残性疾病排名中始终靠前;在过去的二十年内中国AIS患者数量明显增长。超过三分之一的AIS患者在患病后会遗留终身后遗症,给家庭和社会带来沉重的负担,所以我们仍需更加深入阐释AIS发生时脑组织的病理生理变化和代谢异常,以期找到更加有效的预防或治疗措施。AIS发生时中心坏死区域细胞虽然迅速坏死难以挽救,但缺血半暗带内的神经元进入凋亡程序,仍具备拯救的时间窗。本研究以缺血半暗带内进行凋亡的神经元为主要研究对象,探索其中RCAN1的表达变化、RCAN1对凋亡的影响及RNA适配体对RCAN1功能的调控作用。氧糖剥夺和颈动脉结扎是常用来模拟AIS的体外模型和体内模型。我们的研究发现在体内、体外AIS模型中,发生缺氧缺糖时RCAN1蛋白均发生明显表达变化,这种改变会对AIS过程中的神经元凋亡进程发生何种影响,期间如果加入RNA适配体与RCAN1蛋白结合后又会产生什么改变。以上均是我们的研究目标。研究方法1.RCAN1蛋白是否作为RNA结合蛋白对ANT1 mRNA发生作用1.1 RNA 免疫共沉淀法(RNAImmunoprecipitation assay,RIP):HEK293 细胞转染高表达RCAN1.1S且有Flag和Myc标签的质粒48小时,使用免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)从细胞裂解液中得到纯化且未破坏蛋白-RNA结合状态的RCAN1.1S蛋白及与其结合的RNAs复合体。Trizol法提取RNAs后使用ANT1mRNA上下游引物进行PCR扩增以确定ANT1 mRNA是否可与RCAN1蛋白结合后形成蛋白-RNA复合体。1.2 RNA结合位点预测:在蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)内检索RCAN1蛋白的可能RNA结合域,其中预测认为小鼠源RCAN1.1S蛋白的第14-103位氨基酸序列可能是RNA结合位点,等待验证。1.3 RCAN1.1S蛋白纯化:RCAN1蛋白具有高度同源性,我们假设人源RCAN1蛋白的RNA结合域与小鼠源的类似。将高表达人源RCAN1.1S-1-103截短蛋白(包含第1-103位氨基酸序列)的质粒pET-28a-RCAN1.1S-1-103-6×his感染BL21(DE3)感受态细胞,大批量选择性培养后用HIS镍柱纯化法从总蛋白中提纯RCAN1.1S-1-103蛋白。1.4胰酶酶解分析:当RNA结合蛋白在与RNAs结合形成复合体后,复合体可一定程度地保护蛋白免受胰酶酶解。将纯化的RCAN1.1S-1-103蛋白单独或者与ANT1 mRNA结合后使用适合浓度的胰酶酶解,观察二者经过消化后产生的蛋白片段有何不同。1.5核糖核酸酶A(RibonucleaseA,RNaseA)酶解实验:RNA结合蛋白在与RNAs结合形成复合体时较稳定,而加入RNase A在合适条件下孵育后可酶解复合体中的RNAs,与之结合的RNA结合蛋白稳定性降低发生降解。本部分在上述高表达RCAN1.1S蛋白的HEK293细胞中提取总蛋白,加入RNase A或空白对照,观察两组中RCAN1蛋白状态的差异。2.RCAN1蛋白在细胞内的分布2.1核质蛋白分离后免疫印迹分析(Westernblot,WB):HEK293细胞转染高表达RCAN1.1S或RCAN1.1S-1-103蛋白的质粒后进行核质蛋白分离,分别提取细胞核及细胞质蛋白后进行Western blot分析,测定RCAN1蛋白在细胞内分布情况。2.2 细胞免疫荧光染色(Immunol fluorescence stain,IF):HEK293 细胞转染高表达RCAN1.1S或RCAN1.1S-1-103蛋白的质粒后进行细胞IF染色,使用共聚焦显微镜观察RCAN1蛋白分布位置。3.RCAN1蛋白的体外RNA适配体筛选及二者亲和力检测3.1利用指数级富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)在体外筛选与RCAN1.1S蛋白具有高亲和力的RNA适配体。3.2选择筛选出的其中一条RNA适配体(命名为R1SR13)及对照RNA,合成后使用表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)检测RNAs与RCAN1.1S蛋白在体外的亲和力。3.3 RNA pull-down实验:HEK293细胞转染高表达RCAN1.1S-1-103质粒后提取蛋白与生物素标记的RNA适配体R1SR13共同孵育,或加入10倍量的无标记R1SR13竞争结合,对照RNA为阴性对照,以此实验验证RCAN1.1S-1-103 与 R1SR13 结合情况。4.体内可与RCAN1蛋白结合的RNAs检测4.1 RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术(RNA-immunoprecipitation high-throughput sequencing,RIP-seq):HEK293 细胞转染高表达 RCAN1.1S 质粒48小时后使用RIP从细胞裂解液中得到未破坏蛋白-RNA结合状态的RCAN1.1S蛋白及与蛋白结合的RNAs,之后进行高通量测序得到RNAs序列。4.2 SPR技术验证测序得到的各个RNA序列与RCAN1.1 S蛋白的亲和力。5.RCAN1蛋白与ANT1 mRNA的结合位点分析5.1 RNA体外转录:使用PCR技术从质粒pCMV10-3×flagANT1扩增ANT1 DNA 1-327nt、250-327nt及488-894nt片段,以此为模板在体外分别将三个片段转录为RNA并纯化。5.2 RNA凝胶迁移:纯化的ANT1 mRNA 1-327nt和488-894nt片段分别与RCAN1.1S-1-103 纯化蛋白孵育后进行RNA 凝胶迁移电泳(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA),观察两条 RNA 与蛋白能否结合。5.3 SPR:首先检测上述 ANT1 mRNA 1-327nt、250-327nt 和 488-894nt 与RCAN1.1S-1-103纯化蛋白的具体亲和力。此外对比ANT1 mRNA与R1SR13碱基序列,发现ANT1 mRNA一段序列(269-291nt)与之非常相似,假设此区域为RCAN1蛋白的结合位点,使用SPR检测亲和力验证。合成ANT1 mRNA 269-291nt及其上下游共3段对照RNA片段(分别是246-268nt、292-314nt 和 315-337nt),检测此 4 段 RNAs 与 RCAN1.1S-1-103纯化蛋白的亲和力,据此确定关于RCAN1蛋白与ANT1 mRNA结合位点的假设成立与否。6.RNA适配体R1SR13对RCAN1下游信号通路影响双荧光素酶报告基因检测:以往研究证实,RCAN1可抑制活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T cells,NFAT)及核因子活化 B 细胞 κ 轻链增强子(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)转录活性。本部分将用双荧光素酶报告系统检测RNA适配体R1SR13及其高表达质粒对NFAT及NF-κB通路转录活性影响。7.RNA适配体R1SR13对RCAN1促神经元凋亡功能的调控研究7.1大鼠胎鼠原代神经元提取及慢病毒感染:取孕18天大鼠的胎鼠大脑皮层神经元进行体外培养。培养至第5天时可加入慢病毒感染以表达目的基因,72h后可进行后续实验。7.2 Western blot检测剪切后Caspase-3蛋白水平。7.3 TUNEL检测凋亡水平。7.4荧光素酶法检测ATP水平和Caspase 3/7蛋白活性。8.体外AIS模型体外建立SH-SY5Y细胞和大鼠胎鼠原代神经元的氧糖剥夺模型(Oxygen and glucose deprivation model,OGD model)。9.OGD过程中RCAN1.1转录及翻译水平变化9.1 实时定量 PCR(Taqman 法)检测 OGD 0-10h RCAN1.1 mRNA 表达变化(每隔2h)。9.2 Western blot 检测 OGD 0-10h RCAN1.1L 蛋白表达变化(每隔 2h)。10.OGD过程中RCAN1.1的变化对细胞凋亡的影响10.1以慢病毒为载体感染SH-SY5Y细胞,腺相关病毒9型(Adenovirus associated virus 9,AAV9)为载体感染神经元的方式过表达或干扰RCAN1,后进行下述试验。10.2 TUNEL、Western blot(剪切后Caspase-3蛋白)及荧光素酶法(ATP水平和Caspase 3/7蛋白活性)检测过表达或干扰RCAN1对OGD过程中细胞凋亡的影响。11.RNA适配体对于OGD过程中细胞凋亡有何改变TUNEL、Western blot(剪切后Caspase-3蛋白)及荧光素酶法(ATP水平和Caspase 3/7蛋白活性)检测加入RNA适配体与RCAN1.1蛋白相互作用后对OGD过程中细胞凋亡的影响。12.小鼠单侧颈总动脉结扎模型缺血侧海马CA1区RCAN1.1表达变化8周龄的C57BL/6雄性小鼠进行右侧颈总动脉结扎,对侧给予假手术处理,按照结扎时间(分别为Oh、2h、4h和6h)分为4组,每组6只。结扎时间完成后取小鼠大脑双侧海马CA1区,以实时定量PCR法(taqman法)检测RCAN1.1 mRNA表达情况,以Western blot检测观察RCAN1.1L蛋白表达情况。研究结果1.RCAN1蛋白与ANT1 mRNA结合RIP结果显示,监测细胞内分离出的RCAN1.1S蛋白-RNAs复合体,使用实时定量PCR可扩增出ANT1 mRNA片段;当体外ANT1 mRNA与纯化的RCAN1.1S-1-103蛋白结合后可减少胰蛋白酶对其酶解作用。以上结果说明RCAN1蛋白可与ANT1mRNA结合。2.RCAN1蛋白主要位于核内核质蛋白分离后Westernblot检测及IF染色结果均显示RCAN1.1S蛋白及其截短蛋白RCAN1.1S-1-103均主要表达于核内。3.R1SR13为RCAN1蛋白的RNA适配体SELEX筛选出与RCAN1蛋白具有高亲和力的RNA适配体,挑选一条命名为R1SR13。体外合成R1SR13及其对照RNA单链,利用SPR及RNA pull-down实验均证实R1SR13与RCAN1蛋白具有极高亲和力。4.细胞内存在多条可与RCAN1蛋白结合的RNAs4.1 RNase A酶解实验说明与RCAN1结合的RNAs可起到维持蛋白稳定性的作用。4.2 RIP-Seq预测出细胞内存在多条可与RCAN1蛋白结合的RNA单链序列,使用SPR证明这些检测出的RNA序列与RCAN1蛋白的亲和力均高于对照。5.RCAN1蛋白在ANT1 mRNA的结合位点RNA EMSA 发现 ANT1 mRNA 1-327nt 可与 RCAN1.1S-1-103 蛋白结合后迁移变慢,而ANT1 mRNA488-894nt与蛋白孵育后无此现象。SPR结果表明RCAN1蛋白在ANT1 mRNA的结合位点位于269-291nt,此区域序列与R1SR13高度类似。6.RNA适配体R1SR13对RCAN1蛋白功能的影响6.1之前的研究发现RCAN1蛋白可以抑制NFAT和NF-κB的转录活性,加入R1SR13与RCAN1蛋白结合后可逆转RCAN1对NFAT和NF-κB转录活性的抑制,其效果与小干扰RNA siRCAN1的作用类似。6.2 RCAN1在原代神经元中可通过激活Caspase-3凋亡通路促进凋亡。RNA适配体R1SR13与RCAN1蛋白结合后可通过抑制Caspase-3蛋白剪切而减少原代神经元凋亡。7.SH-SY5Y细胞和原代神经元OGD过程中RCAN1 mRNA和蛋白水平均升高SH-SY5Y细胞和原代神经元分别在OGD 4h或6h时RCAN1.1mRNA水平最高,而OGD 6h或8h时两种细胞RCAN1.1L蛋白水平达到最高峰。8.OGD时SH-SY5Y和原代神经元内升高的RCAN1促进凋亡TUNEL、Western blot(剪切后 Caspase-3 蛋白)及荧光素酶法(ATP水平和Caspase 3/7蛋白活性)检测均证明,OGD 6h时在SH-SY5Y和原代神经元中高表达的RCAN1.1L促进凋亡,而抑制RCAN1表达后凋亡程度减轻。9.RNA适配体R1SR13可减轻SH-SY5Y细胞和原代神经元在OGD时RCAN1高表达的促凋亡作用TUNEL、Western blot(剪切后 Caspase-3 蛋白)及荧光素酶法(ATP水平和Caspase 3/7蛋白活性)检测均证明,加入R1SR13后可减轻SH-SY5Y细胞和原代神经元在OGD 6h时RCAN1.1升高后的促凋亡作用。10.单侧颈总动脉结扎后的C57BL/6小鼠脑组织海马CA1区RCAN1.1表达较对侧升高实时定量PCR(Taqman法)和Western blot均发现C57BL/6雄性小鼠单侧颈总动脉结扎后海马CA1区RCAN1.1的mRNA水平和蛋白水平均较对侧升高。结论1.RCAN1蛋白为RNA结合蛋白,与ANT1 mRNA结合位点在269-291 nt。2.急性缺血性脑卒中的氧糖剥夺细胞模型中RCAN1表达升高且促进细胞凋亡;小鼠颈总动脉单侧结扎动物模型中结扎侧海马CA1区RCAN1mRNA水平和蛋白水平均升高。3.R1SR13是体外由SELEX筛选出的RCAN1蛋白的高亲和力RNA适配体,二者结合后RCAN1蛋白的功能被抑制。具体表现在R1SR13缓解RCAN1对于NFAT和NF-κB转录活性的抑制作用;在高表达RCAN1或氧糖剥夺细胞模型中均可逆转RCAN1的促凋亡作用。研究意义1.本研究首次证实RCAN1蛋白为一种RNA结合蛋白,为RCAN1相关研究提供了更广阔的思路;并阐释了 RCAN1蛋白与ANT1 mRNA的相互作用机制。2.发现了 AIS模型中RCAN1的表达变化及作用,丰富了 AIS过程中对神经元凋亡调控的机制研究。3.RNA适配体R1SR13可抑制RCAN1蛋白的功能,未来有望在AIS和AD等多种疾病中发挥靶向治疗作用。