microRNA(miRNA)是一种大小约21～23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工而成，在线虫、植物、昆虫和哺乳动物都有发现。近年来，随着对miRNA在生物个体发育过程中的基因表达调控作用的认识，使得miRNA的研究倍受关注，并成为当前生命科学理论和应用研究的热点。在理论方面，重点研究miRNA如何通过参与转录后基因表达的调控，在细胞分化、增殖和死亡、发育调控等方面发挥作用；在应用方面，以miRNA为靶向的小分子RNA药物正在成为生物药物开发新热点，而组织特异性miRNA表达谱有可能成为肿瘤诊断、分级、分类与预后的新标志。一、miRNA在胚胎脊髓发育中作用机制的研究目的：筛选并鉴定胚胎脊髓组织中特异性miRNA，分析其在脊髓神经细胞分化、增殖和发育过程中的基本功能，为深入研究胚胎神经系统正常发育和畸形形成机制提供基础。方法：首先应用寡核苷酸芯片技术分析人12孕周和24孕周流产胎儿不同器官的全基因组miRNA表达谱，通过Northern Blot和聚类分析确定脊髓等中枢神经系统特异性miRNA；通过全反式维甲酸(RA)诱导建立大鼠胚胎脊柱裂动物模型，根据大鼠胚胎发育情况，分别在第13.5、15.5、17.5和19.5天取出胚胎，采用miRNA组织细胞原位杂交和Northern Blot等方法检测脊髓发生过程中miRNA的表达情况，分析脊髓组织特异miRNA在神经细胞分化、增殖和发育中的作用。结果：(1)分别构建了12周和24周人胚心脏、肝、肾、肺、脑、脊髓等组织器官的全基因组miRNA表达谱，结果显示158种人源miRNA的72％-83％在胚胎组织器官中表达，且相同发育阶段的不同组织器官miRNA表达谱不同，而不同发育阶段的相同组织器官，miRNA表达谱也不同；通过聚类分析，首次发现mir-9／9~*仅在人胎儿神经系统中表达，包括大脑和脊髓，以及miR-124a、miR-125b和miR-128等三种与mir-9／9~*协同表达的胚胎神经系统特异miRNA。(2)在RA诱导的脊柱裂大鼠脊髓细胞凋亡明显增加，表明RA处理可诱导胚胎发育晚期脊髓细胞的非正常死亡；Bcl-2与miR-9／9~*以及P53与miR-124a／125b具有相同的时空表达模式；且运动神经元和背根神经节中miR-124a／125b表达缺失。结论：(1)本论文在大脑、脊髓等人胚胎神经系统首次发现了独特的miRNA表达谱，提示miRNA在人胚胎大脑和脊髓发育过程中起重要作用。(2)本论文发现，RA诱导脊髓特异性miRNA表达下调主要为时空表达模式的失调，提示这些miRNA有可能通过RA诱导下调，进而影响脊髓的正常发育或诱导了细胞凋亡；此外，本研究结果还显示miR-9／9~*和miR-124a／125b可能通过调控Bcl-2和P53通路，在感觉和运动神经元发育过程中发挥作用。二、miRNA用于神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤分类研究目的：以神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤为对象，筛选并构建肿瘤组织特异性miRNA表达谱，研究其作为肿瘤分级、分类及预后分子标志的可行性。方法：根据WHO临床分级标准收集新鲜的神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤样本，通过福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)制作组织芯片(TMA)，采用miRNA芯片、组织细胞原位杂交(ISH)和Northern Blot等方法确定肿瘤组织miRNA表达特征，采用免疫组织化学方法检测肿瘤相关蛋白标记，包括Ki-67、VEGF和GFAP等在肿瘤组织的定位与表达情况，通过聚类分析构建肿瘤组织miRNA特异性表达谱。结果：(1)对神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征的研究结果显示，人神经胶质细胞瘤中miR-9和miR-21表达的增加，而miR-124a、miR-125b表达的减少，结合病理诊断，发现组织特异性miRNA表达模式与神经胶质细胞瘤的病理分级相关；此外，miRNA总体表达水平与Ki-67、VEGF以及GFAP标志物之间呈负相关。(2)对视网膜母细胞瘤组织miRNA表达特征研究结果显示，肿瘤组织基因组miRNA整体表达水平高于正常对照，有11种miRNA表达水平超过正常视网膜组织的2倍(N／T＜0.5)，其中表达水平高于正常水平4倍的有miR-373*、miR-503和miR-320；该结果与Northern Blot和组织细胞原位杂交结果一致。结论：(1)根据本论文对神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征的研究结果表明，miRNA是一类不同于现有肿瘤标志物的新型分级、分类标志物，同时结合临床病程、病理诊断以及聚类分析，提示神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征也可用于预后以及放、化疗敏感性或耐药性的判定，并特别提出miR-9、miR-21、miR-124a和miR-125b可能是神经胶质瘤诊断、治疗和预后评估的关键标志物。(2)在对视网膜母细胞瘤组织miRNA表达特征的研究中，首次发现肿瘤基因组miRNA整体表达水平增高，提示视网膜母细胞瘤的发病机制可能与其他实体瘤不同，其中miR-373*、miR-503和miR-320表达水平远高于其他miRNA，提示其可能是在视网膜母细胞瘤发生、发展中起重要作用的调控分子。