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癌症正在成为导致人类死亡的首要病因。有效的药物依然是国内外临床治疗的迫切需求。天然产物因结构和生物活性的多样性,是抗肿瘤药物研究的重要资源。环庚三烯酚酮（tropolone）类化合物主要来源于真菌的次级代谢产物,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、杀虫及抗肿瘤等生物活性,其抗肿瘤作用成为近年研究的新热点。然而,受限于天然产物结构的复杂性和可获得性,截至目前,该类结构化合物药用研究尚没有突破,其作用机制不清,也未发展成为抗肿瘤候选药物。Eupenifeldin是tropolone类化合物的一种,1993年首次从Eupenicillium brefeldianum ATCC74184菌株发现。之后,本研究室车永胜研究员在茎点菌（Phoma sp.）XZ068菌株中也分离到eupenifeldin,编号为C1055,并且通过分离技术的优化获得较高产率与纯度。报道表明,eupenifeldin在多种肿瘤细胞上具有较好的抗肿瘤细胞活性,延长P388白血病小鼠生存时间,提示,该化合物在体内外均具有较好的生物活性。然而,作为tropolone类化合物的代表分子,其抗肿瘤作用及机制尚不清楚。本课题的研究目的是进一步确证和评价eupenifeldin（C1055）及其类似物C1057的抗肿瘤活性、系统筛查和研究其作用机制。研究内容包括以下四个部分。第一,采用MTT、SRB和肿瘤细胞集落实验评价了C1055和C1057的抗肿瘤活性。结果显示:C1055和C1057具有明确抑制肿瘤细胞活力和增殖的作用。两化合物抑制Bx PC3、H4、U251、HepG2、SKOV3、PANC-1、SH-SY5Y、HeLa细胞增殖的IC50值分别为C1055:（6.95±2.19）、（8.40±3.59）、（8.93±0.95）、（10.33±0.60）、（10.97±0.44）、（24.60±10.10）、（29.71±2.70）、（40.30±7.53）nM,C1057:（0.56±0.14）、（0.73±0.09）、（0.63±0.12）、（0.57±0.05）、（0.65±0.03）、（0.48±0.13）、（1.14±0.038）、（2.07±0.62）μM。C1055（1、3、10nM）和C1057（10、30、100nM）显著抑制BxPC3细胞和H4细胞的集落形成。第二,采用基于细胞荧光成像的高内涵分析技术,以细胞毒性14个参数的动态变化、16株稳定表达EGFP-肿瘤相关信号通路标志蛋白和5株稳定表达EGFP-细胞应激反应通路标志蛋白的报告细胞系统筛查了化合物的作用机制。结果显示,C1055处理HepG2细胞24h,浓度依赖地（1-100nM）减少存活细胞的数量、细胞GSH含量,在30-100nM显著增加细胞ROS、MnSOD含量、核膜通透性（NMP）,仅在100nM浓度下显著增加细胞pH2AX（DNA损伤）、LC3B（自噬标志物）含量,增加溶酶体（Lysosome）数量、降低线粒体膜电位（MMP）,并伴有30%细胞死亡,但不明显改变细胞核形态相关参数（Nuc Area,Nuc Elongation,Nuc 1/（Form Factor）,Nuc Intensity,Nuc Intensity CV）。此外,C1055（30nM）和C1057（0.3μM）表现出时间依赖地（6-24h）降低HepG2细胞GSH含量。信号通路筛查的结果显示,C1055 300 nM和C1057 3μM仅诱导Rad51-EGFP-SW480细胞的Rad51核颗粒形成（分别为85%和48%）并伴随有30%左右的细胞死亡;抑制EGFR-EGFP-U2OS细胞中EGFR在胞浆的重分布（分别为22%和66%）即化合物仅在诱导肿瘤细胞死亡的浓度下导致细胞DNA损伤,诱导EGFR通路抑制。第三,在Bx PC3和H4细胞上进一步验证了两化合物浓度和时间依赖地降低细胞GSH含量,在此基础上,采用Q-PCR技术测定了化合物对GSH合成相关蛋白（谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL,包括催化亚基GCLC和调控亚基GCLM）、谷胱甘肽合成酶（GSS）、谷胱甘肽还原酶（GR））和代谢蛋白（谷胱甘肽S转移酶（GST））的mRNA表达的影响,并检测了化合物处理细胞不同时间点（1,3,6,9,12h）BxPC3、H4细胞的GST活性。结果显示,C1055和C1057浓度依赖地上调GSH合成和代谢相关蛋白的mRNA表达,诱导GST活性增强。鉴于两化合物均不能诱发Nrf2聚集及核转位,提示,C1055和C1057可能主要通过促进GST酶活性增强,减少细胞内GSH含量。第四,通过细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放测定,结合特异性死亡通路抑制剂,对C1055和C1057诱导的肿瘤细胞死亡方式进行了初步筛查,结果显示,Z-VAD-FMK、3-MA、necrostatin-1、ferrostatin-1分别逆转了C1055和C1057诱导的BxPC3细胞LDH释放;Z-VAD-FMK、ferrostatin-1分别逆转了C1055（30,100,300nM）诱导的H4细胞LDH释放;Z-VAD-FMK逆转了C1057（0.3,1,3μM）诱导的H4细胞LDH释放。流式细胞凋亡检测、HCA检测自噬标志分子LC3B、程序性坏死、铁死亡标志物脂类过氧化物（LPO）分析进一步证实,在Bx PC3中,两种化合物均能够浓度依赖地诱导肿瘤细胞凋亡、LC3B表达升高,其中C1055亦可诱导细胞铁死亡;在H4细胞上,两化合物浓度依赖地诱导极高比例的细胞凋亡,C1055作用尤其显著,并诱导细胞铁死亡。综合以上研究结果,本课题获得以下研究结论:1.Eupenifeldin（C1055）及其类似物C1057在体外具有明确的抗肿瘤活性,在本实验选择的肿瘤细胞上,C1055抑制肿瘤细胞增殖的IC50值为8-29nM,C1057为0.5-2μM;两化合物对细胞的选择性不超过10倍,具有较为广谱的抑制肿瘤细胞的作用。2.C1055及其类似物C1057时间和浓度依赖地降低肿瘤细胞GSH含量;增强细胞内GST活性,促进GSH转化可能是C1055及其类似物C1057降低胞内GSH含量的主要原因。3.C1055和C1057诱导的肿瘤细胞死亡方式具有细胞依赖性。两化合物均能够诱导Bx PC3细胞发生凋亡和自噬,诱导H4细胞发生凋亡;C1055诱导Bx PC3和H4细胞发生铁死亡。4.鉴于特异性耗竭肿瘤细胞内GSH是肿瘤治疗一个重要策略,作为真菌来源的先导分子,C1055和C1057抗肿瘤效应值得进一步研究。