论文部分内容阅读
目的：本文探讨新型非编码RNA分子——piRNAs介导白血病细胞p15INK4b基因甲基化修饰和/或异染色质形成的可能机制，为白血病发生、发展提供新的方向。方法：首先，采用荧光定量PCR与Western Blotting方法检测p15INK4b基因在急性白血病患者中的表达水平，同时应用基因甲基化检测技术检测p15INK4b基因启动子区CpG岛的甲基化水平，染色质免疫共沉淀技术分析p15INK4b基因启动子区异染色质水平，分析DNA甲基化和/或异染色质水平的临床意义；其次，采用荧光定量PCR检测p15-piRNAs分子表达水平，利用RNA免疫共沉淀技术鉴定Piwi亚家族AGO3蛋白与p15-piRNAs分子的结合水平，蛋白质免疫共沉淀技术鉴定piRNA-Piwi通路组件及其成分；最后，采用诱导细胞系过表达p15-piRNAs分子，分析其对基因表达、DNA甲基化和异染色质等的影响。结果：（1）急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者p15INK4b基因的表达水平较正常人和急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）患者明显减低（RQ=0.08±0.06， p=0.00<0.05）；甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）检测ALL患者基因甲基化的阳性率为100%，而AML患者为42.9%，差别具有统计学意义（P=0.016<0.05）；在细胞系Molt-4中p15INK4b基因启动子区CpG岛中45个CG位点发生了高甲基化修饰，细胞系U937则无发生甲基化；在Molt-4中p15INK4b基因启动子区的组蛋白H3K9发生了单甲基化和双甲基化修饰（P≤0.05），相反在细胞系U937中该基因组区域的组蛋白H3K9和H3K27无发生甲基化修饰（P>0.05）；（2）hsapiR014637、hsapiR011186分子在细胞系Molt-4和U937中存在差异性表达，细胞系Molt-4的相对表达水平较高，且以hsapiR011186分子较明显（p=0.003<0.05）。在细胞系Molt-4中，两个p15-piRNAs分子与AGO3蛋白的相互作用程度高于细胞系U937，以hsapiR011186分子为明显（p≤0.05）；细胞系Molt-4和U937均存在piRNA-AGO3通路组件，组成成分存在着差异性；在细胞系Molt-4中通路组件含有Suv39H1、EZH2、DNMT3a和DNMT3b等蛋白，不具有DNMT1蛋白；在细胞系U937中通路组件同样含有Suv39H1和EZH2蛋白，但含量低于细胞系Molt-4，且Suv39H1的含量较EZH2蛋白低，另外该组件不含DNMT3a和DNMT3b蛋白，而含有DNMT1蛋白；（3） U937转染细胞分别过表达hsapiR014637和hsapiR011186分子，两者的表达水平无差别（p=0.80>0.05），但是两者与AGO3蛋白的结合水平存在着差异性（p=0.002<0.05），hsapiR011186转染组的结合水平相当较高；U937转染细胞出现p15INK4b基因表达明显下调，以hsapiR011186转染组为明显（p=0.00<0.05）； hsapiR011186转染组的p15INK4b基因启动子区DNA发生了甲基化修饰，而其它组无发生甲基化；相对于阴性对照组，hsapiR014637和hsapiR011186转染组的p15INK4b基因启动子区组蛋白H3均发生不同程度的甲基化修饰改变（p≤0.05），hsapiR011186转染组的组蛋白H3甲基化修饰程度较为明显（p≤0.05），以H3K27的双甲基化修饰为明显（p≤0.05）。结论:不同类型白血病细胞存在p15-piRNAs分子的差异性表达，并存在由不同的表观遗传调控分子组成的piRNAs-Piwi通路组件，该组件含有通过piRNAs分子的序列互补性，特异性地定位结合于p15INK4b基因组上，表观遗传调控分子催化基因启动子区DNA和/或组蛋白H3发生甲基化修饰，进而调控基因表达。