p15-piRNAs介导白血病细胞p15INK4b基因DNA与组蛋白甲基化修饰机制研究

来源 :福建医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jingqihao
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目的:本文探讨新型非编码RNA分子——piRNAs介导白血病细胞p15INK4b基因甲基化修饰和/或异染色质形成的可能机制,为白血病发生、发展提供新的方向。方法:首先,采用荧光定量PCR与Western Blotting方法检测p15INK4b基因在急性白血病患者中的表达水平,同时应用基因甲基化检测技术检测p15INK4b基因启动子区CpG岛的甲基化水平,染色质免疫共沉淀技术分析p15INK4b基因启动子区异染色质水平,分析DNA甲基化和/或异染色质水平的临床意义;其次,采用荧光定量PCR检测p15-piRNAs分子表达水平,利用RNA免疫共沉淀技术鉴定Piwi亚家族AGO3蛋白与p15-piRNAs分子的结合水平,蛋白质免疫共沉淀技术鉴定piRNA-Piwi通路组件及其成分;最后,采用诱导细胞系过表达p15-piRNAs分子,分析其对基因表达、DNA甲基化和异染色质等的影响。结果:(1)急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者p15INK4b基因的表达水平较正常人和急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)患者明显减低(RQ=0.08±0.06, p=0.00<0.05);甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)检测ALL患者基因甲基化的阳性率为100%,而AML患者为42.9%,差别具有统计学意义(P=0.016<0.05);在细胞系Molt-4中p15INK4b基因启动子区CpG岛中45个CG位点发生了高甲基化修饰,细胞系U937则无发生甲基化;在Molt-4中p15INK4b基因启动子区的组蛋白H3K9发生了单甲基化和双甲基化修饰(P≤0.05),相反在细胞系U937中该基因组区域的组蛋白H3K9和H3K27无发生甲基化修饰(P>0.05);(2)hsapiR014637、hsapiR011186分子在细胞系Molt-4和U937中存在差异性表达,细胞系Molt-4的相对表达水平较高,且以hsapiR011186分子较明显(p=0.003<0.05)。在细胞系Molt-4中,两个p15-piRNAs分子与AGO3蛋白的相互作用程度高于细胞系U937,以hsapiR011186分子为明显(p≤0.05);细胞系Molt-4和U937均存在piRNA-AGO3通路组件,组成成分存在着差异性;在细胞系Molt-4中通路组件含有Suv39H1、EZH2、DNMT3a和DNMT3b等蛋白,不具有DNMT1蛋白;在细胞系U937中通路组件同样含有Suv39H1和EZH2蛋白,但含量低于细胞系Molt-4,且Suv39H1的含量较EZH2蛋白低,另外该组件不含DNMT3a和DNMT3b蛋白,而含有DNMT1蛋白;(3) U937转染细胞分别过表达hsapiR014637和hsapiR011186分子,两者的表达水平无差别(p=0.80>0.05),但是两者与AGO3蛋白的结合水平存在着差异性(p=0.002<0.05),hsapiR011186转染组的结合水平相当较高;U937转染细胞出现p15INK4b基因表达明显下调,以hsapiR011186转染组为明显(p=0.00<0.05); hsapiR011186转染组的p15INK4b基因启动子区DNA发生了甲基化修饰,而其它组无发生甲基化;相对于阴性对照组,hsapiR014637和hsapiR011186转染组的p15INK4b基因启动子区组蛋白H3均发生不同程度的甲基化修饰改变(p≤0.05),hsapiR011186转染组的组蛋白H3甲基化修饰程度较为明显(p≤0.05),以H3K27的双甲基化修饰为明显(p≤0.05)。结论:不同类型白血病细胞存在p15-piRNAs分子的差异性表达,并存在由不同的表观遗传调控分子组成的piRNAs-Piwi通路组件,该组件含有通过piRNAs分子的序列互补性,特异性地定位结合于p15INK4b基因组上,表观遗传调控分子催化基因启动子区DNA和/或组蛋白H3发生甲基化修饰,进而调控基因表达。
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