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第二章人脑微血管内皮细胞的培养【目的】探讨人脑微血管内皮细胞(human brain endothelial cells,hCMEC/D3)培养、传代、冻存、生长周期规律、HIV-1Tat对细胞毒性作用以及HIV-1Tat对细胞内活性氧含量的影响。观察hCMEC/D3的生物学特性和药物对其的抑制性作用，为下一阶段提供hCMEC/D3进行药物的处理及蛋白的提取奠定基础。【方法】应用倒置相差显微镜观察hCMEC/D3传代后细胞的形态特征、生长情况、绘制hCMEC/D3的生长曲线。采用甲基噻唑基四唑(Matrixmetalloproteinases,MTT）比色法测定HIV-1Tat蛋白对hCMEC/D3活性的影响。应用荧光分光光度计，以2‘,7‘-二氯荧光素为荧光探针检测HIV-1Tat对细胞内活性氧含量的影响。【结果】传代培养的hCMEC/D3在显微镜下形态呈多角形或长梭形细胞，向四周伸出细长突起，互不重叠的单层“鹅卵石”状。hCMEC/D3的生长曲线显示，细胞经过3-4天进入指数生长期，生长速度加快。MTT法测定发现1ug/ml HIV-1Tat作用hCMEC/D324h后对细胞的抑制率分别为2.84%、7.80%、13.48%。用荧光分光光度计检测发现1μg/ml HIV-1Tat组活性氧含量的平均荧光强度（10.315±0.648），明显高于空白对照组（P<0.001）。【结论】经传代后培养细胞生长能力强，性状稳定。给予1ug/ml HIV-1Tat处理细胞24h后对细胞生长的活性无明显影响。HIV-1Tat可诱导细胞内活性氧含量升高。第三章雌激素抑制HIV-1诱导hCMEC/D3间紧密连接蛋白表达的影响【目的】初步探讨雌激素、HIV-1Tat诱导hCMEC/D3紧密连接蛋白表达的作用。【方法】采用蛋白免疫印迹（Western blot, WB）技术检测hCMEC/D3中蛋白表达变化。同代人脑微血管内皮细胞（human brain endothelial cells，hCMEC/D3)分为培养基对照组(CTL组)给予无血清培养基处理；Tat组给予1μg/ml HIV-1Tat；17β-雌二醇（E2）组给予10-8mol/L17β-E2处理；Tat+E2组以浓度10-8mol/L17β-E2预处理2小时后，再加入1μg/ml HIV-1Tat共处理24小时。【结果】HIV-1Tat蛋白对人脑微血管内皮细胞处理24小时后，整合膜蛋白-1（Claudin-1）,带状闭合蛋白-1（zona occludens-1, ZO-1),带状闭合蛋白-2(zona occludens-2, ZO-2)蛋白表达下调，（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。E2可诱导Claudin-1,ZO-1的蛋白表达上调（P<0.01，P<0.05），同时抑制HIV-1Tat诱导Claudin-1,ZO-2蛋白表达下调（P<0.05，P<0.01），但对ZO-1蛋白表达调节无统计学意义（P>0.05）。【结论】 HIV-1Tat诱导人脑微血管内皮细胞间紧密连接蛋Claudin-1,ZO-1,ZO-2降解。然而，雌激素可抑制HIV-1Tat诱导紧密连接蛋白Claudin-1,ZO-2降解。