乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤之一,对女性身体健康造成极大威胁。在全世界范围内,乳腺癌以11.6%的发病率高居女性肿瘤发病率的首位,在我国,根据国家癌症中心发布的《2018年中国肿瘤的现状和趋势》报告,乳腺癌发病率同样位列女性肿瘤发病率的第一位,且与西方发达国家相比,存在死亡率高、发病年龄早等特点。因此,进一步研究并明确有效的治疗靶点对于乳腺癌病人的预后及诊断治疗具有重要的理论意义。泛素化蛋白酶体系统负责蛋白质的降解,参与了几乎所有的细胞过程,泛素系统的调节失衡会导致包括癌症在内的多种疾病。Cullin蛋白质家族包含Cullin保守同源结构域,是一种主要类型的E3连接酶。CUL4A(Cullin4a)是Cullin蛋白家族的一员,属于泛素连接酶E3家族。在实验室前期工作中,发现Cu14A基因在乳腺癌的侵袭转移过程中发挥着重要的促进作用,CUL4A在体内通过与DDB1及DCAF(CUL4-DDB1 associated factors)蛋白形成复合物,从而介导底物蛋白的降解,其中,CUL4A蛋白在该复合物中充当结构骨架,DCAFs作为底物识别体直接介导底物降解。DTL又称CDT2、DCAF2 或 RAMP(retinoic acid-regulated nuclear matrix-associated protein),是 DCAFs 家族成员之 一,其N端包含7个WD40域。通过对人类乳腺癌病例基因芯片数据的分析,发现DTL基因在乳腺癌组织中表达量明显升高。DTL首先作为在视黄酸诱导的NT2细胞分化过程中下调蛋白而被发现,随后发现其在调节DNA复制和细胞周期过程中发挥重要作用。例如,在酵母中敲除DTL会导致S期的延缓,另外,DTL通过调节CDT1,PR-SET7/SET8和P21的降解,保护细胞S期基因组的稳定和UV照射后DNA损伤的修复。DTL在基因组稳定性中的重要作用表明其在细胞中可能参与肿瘤的发生,先前也有对乳腺癌和尤文氏肉瘤的研究表明,DTL的下调削弱了癌细胞的增殖和迁移能力。然而,关于DTL在癌症中的作用的系统研究还有待评估,DTL调控癌症进展的潜在机制需要更多的研究。程序性细胞凋亡因子4(PDCD4,programmed cell death 4)是一种参与细胞凋亡、转化、侵袭和肿瘤进展的肿瘤抑制基因。PDCD4通过MA3结构域与真核翻译起始因子4A(eIF4A)和4G(eIF4G)相互作用发挥其抑制翻译的作用。已有研究发现,PDCD4表达缺乏与肺癌、卵巢癌、结肠癌和肾癌等多种癌症的进展和预后密切相关。考虑到PDCD4在癌症进展中的重要作用,对癌症中PDCD4表达水平的调控值得进一步研究。本研究主要探讨DTL通过降解PDCD4影响肿瘤的发展,结果表明,DTL通过泛素降解与PDCD4结合并下调PDCD4,促进癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力。本研究探索了 PDCD4在体内降解的途径,并为DTL影响肿瘤发展的机制作出了阐释,从而为开发DTL作为乳腺癌治疗靶点提供了理论依据。第一部分DTL在肿瘤中的表达[目的]利用生物信息学的方法,结合收集的乳腺癌患者肿瘤组织,通过分析TCGA数据库、GEO数据库和GTEx数据库,探究乳腺癌患者组织中DTL基因在基因组中的扩增情况、mRNA表达水平,以及与乳腺癌患者生存期的关系,初步明确DTL在乳腺癌中的临床意义,为进一步研究DTL在乳腺癌中的作用奠定基础。[方法]1.利用公共数据库TCGA分析DTL在多种肿瘤中的表达情况。2.利用公共数据库GEO分析DTL在乳腺癌中的表达情况。3.利用KM plotter分析DTL对病人预后的影响。4.利用实验室现有的乳腺癌细胞株及上皮细胞株,提取总蛋白,进行Western blot实验,检测DTL在乳腺癌细胞中的蛋白表达水平。5.收集山东大学齐鲁医院乳腺外科手术切除的乳腺癌组织及其相对应的癌旁组织,提取总mRNA,进行qRT-PCR实验,检测DTL基因在乳腺癌组织中的表达水平。6.收集山东大学齐鲁医院乳腺外科手术切除的乳腺癌组织及其相对应的癌旁组织,提取总蛋白,进行Westerm blot实验,检测DTL蛋白在乳腺癌组织中的表达水平。7.采用西安艾丽娜生物科技有限公司乳腺癌组织芯片BR2082a中的160例乳腺癌组织和32例正常乳腺组织,通过免疫组化染色实验和统计分析,进一步对DTL在乳腺癌组织中的蛋白水平进行检测。[结果]1.DTL基因位于人类基因组1q32.3区域,乳腺癌病人基因组中DTL基因拷贝数明显增加。2.通过分析TCGA数据库,发现DTL基因在多种组织中表达升高。3.通过分析GEO数据库,发现DTL基因在乳腺癌组织中表达升高。4.DTL高表达与病人生存期负相关。5.对乳腺癌细胞株和乳腺上皮细胞株总蛋白进行Westerm blot实验,结果证明DTL在乳腺癌细胞株中蛋白表达水平上调。6.对收集到的乳腺癌组织及其相对应的癌旁组织中DTL mRNA进行qRT-PCR实验检测,证明在乳腺癌组织中DTL mRNA表达量上调。7.对收集到的乳腺癌组织及其相对应的癌旁组织中DTL总蛋白进行Westerm blot实验检测,证明DTL在乳腺癌组织中DTL在蛋白水平表达上调。8.对组织芯片中乳腺癌组织和正常乳腺组织利用DTL抗体进行免疫组化染色,并利用Image Pro Plus进行量化分析,结果进一步证明DTL蛋白在乳腺癌组织中表达上调。[结论]1.公共数据库分析结果表明,相对于正常乳腺组织,DTL在乳腺癌组织中表达上调。2.DTL高表达与患者不良预后呈现正相关。3.对收集的组织样品和细胞株中DTL的表达量进行分析,结果进一步验证,DTL表达量在肿瘤组织中高表达。第二部分 DTL促进肿瘤增殖及侵袭迁移[目的]根据第一部分中对DTL表达量和病人预后的分析结果,通过体外细胞实验及裸鼠转移模型,探究DTL对乳腺癌增殖、迁移和侵袭功能的影响。[方法]1.构建DTL高表达质粒pLVX-DTL,将其与空白对照质粒pLVX分别和慢病毒包装质粒psPAX,PMD2.G共转染293T细胞株,比例为质量比pLVX:psPAX:PMD2.G=4:3:1,10cm皿总转染质粒数一般为24ng,取细胞培养液上清,过滤后分装在1.5mL离心管中,-80℃保存。使用DTL基础表达水平较低的MCF7、MDA-MB-468、BT549构建DTL稳定高表达细胞系和对照细胞系。通过qRT-PCR和Western blot实验,检测所构建的慢病毒稳转细胞系中DTL mRNA及蛋白的表达水平。2.分别利用慢病毒载体pLKO-TetOn-Puro和pLKO.1构建DTL低表达质粒,分别命名为shDTL#1、shDTL#2、shDTL#3,用随机序列作为空白对照,命名为Scramble。将敲低质粒和空白对照分别与慢病毒包装质粒psPAX,PMD2.G共转染293T细胞株,比例为质量比pLKO:psPAX:PMD2.G=4:3:1,取细胞培养液上清,过滤后分装在1.5mL离心管中,-80℃保存。使用DTL基础表达水平较高的MDA-MB-231构建DTL稳定低表达细胞系和对照细胞系,通过Tet-pLKO-puro质粒建立的细胞系需经过强力霉素诱导表达。通过qRT-PCR和Westerm blot实验,检测所构建的慢病毒稳转细胞系中DTL mRNA及蛋白表达水平。3.通过MTT实验检测细胞活性,克隆形成实验检测细胞增殖能力的改变。4.通过Westerm blot实验检测DTL对上皮间质转化过程的影响。5.通过Transwell实验检测DTL对细胞迁移能力的影响;通过Matrigel实验检测DTL对细胞侵袭能力的影响。6.应用DTL稳定低表达和高表达的细胞系及其对照组细胞系,通过尾静脉注射、皮下注射建立裸鼠转移瘤模型,观察肿瘤形成和转移情况,通过HE染色检测肺组织中转移灶数量。[结果]1.成功构建pLVX-DTL质粒,并通过慢病毒,建立稳定转染MCF7细胞系(MCF7-pLVX,MCF7-DTL)、BT549 细胞系(BT549-pLVX,BT549-DTL)和 MDA-MB-468 细胞系(468-pLVX,468-DTL),经 qRT-PCR 和 Western blot检测,证实DTL高表达稳定转染细胞系构建成功。2.成功构建shDTL#1、shDTL#2及shDTL#1质粒,并通过慢病毒侵染,建立稳定转染MDA-MB-231细胞系(分别命名为231-shDTL#1,231-shDTL#2和231-shDTL#3)。经qRT-PCR和Western blot检测证实DTL低表达稳定转染细胞系构建成功。3.高表达DTL提高乳腺癌细胞增殖能力。4.高表达DTL提高乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。5.裸鼠皮下成瘤实验证明低表达DTL抑制乳腺癌增殖,裸鼠转移瘤实验证明DTL高表达促进乳腺癌细胞体内转移,低表达DTL抑制乳腺癌转移。[结论]1.DTL能够促进乳腺癌细胞的增殖。2.DTL具有促进乳腺癌细胞EMT及体外迁移侵袭转移的能力。3.DTL能够促进乳腺癌细胞体内增殖和侵袭转移。第三部分 DTL通过PDCD4介导促进肿瘤发展[目的]第二部分的体内和体外实验结果基本表明,DTL在乳腺癌中发挥癌基因功能,促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭迁移和上皮间质转化,但其在乳腺癌中的内在调控机制尚不明确,该部分主要研究DTL在乳腺癌中发挥功能的分子机制。[方法]1.利用蛋白凝胶电泳和质谱分析检测和鉴别DTL相互作用蛋白。2.免疫共沉淀方法检测DTL与PDCD4相互作用,在293T细胞中分别用DTL抗体和PDCD4抗体免疫共沉淀,并用Western blot进行检测。3.分别在BT549和MDA-MB-468高表达细胞株中用免疫荧光和激光共聚焦分析检测DTL和PDCD4的定位。4.将pLVX-DTL和pLVX质粒分别转染293T细胞,用qRT-PCR和Western blot方法检测PDCD4的mRNA和蛋白表达水平。pLKO-shDTL#1、pLKO-shDTL#2和pLKO-shDTL#3质粒转染293T细胞,经强力霉素处理后,用Western blot检测PDCD4的mRNA和蛋白表达水平。5.对组织芯片分别用DTL和PDCD4抗体进行免疫组化检测,检测DTL与PDCD4表达相关性。6.分别用MG132单独处理细胞,CHX和MG132联合处理细胞,Western blot方法检测PDCD4蛋白表达水平。7.pLVX-DTL和pLVX质粒分别转染293T细胞,48小时后用CHX处理293T细胞,每隔30分钟提取蛋白,Westerm blot方法检测PDCD4表达量。8.Flag-DTL、Myc-PDCD4 和 HA-ubiquitin 共转染 293T 细胞,Myc 抗体进行免疫共沉淀,随后进行Westerm blot,用HA抗体检测PDCD4泛素化水平。9.构建 PDCD4 低表达质粒 pLKO-shPDCD4#1、pLKO-shPDCD4#2 及 pLKO-shPDCD4#3,将敲低质粒和空白对照分别与慢病毒包装质粒psPAX,PMD2.G共转染293T细胞株,比例为pLKO:psPAX:PMD2.G=4:3:1,取细胞培养液上清,过滤,-80℃保存。选取231-shDTL#1细胞系,用shPDCD4慢病毒侵染,构建 231-shDTL#1-shPDCD#1、231-shDTL#1-shPDCD#2 和 231-shDTL#1-shPDCD#3回补细胞系。通过Westem blot检测所构建的稳定转染细胞系中DTL及PDCD4蛋白表达水平。10.通过MTT实验和克隆形成实验检测回补细胞系增殖能力的改变;通过细胞划痕实验、Transwell实验检测回补细胞系的迁移能力;通过Matrigel实验检测回补细胞系侵袭能力。[结果]1.质谱分析发现PDCD4可能与DTL存在相互结合。2.免疫共沉淀实验证实PDCD4与DTL相互结合。3.三维结构模拟及免疫共沉淀实验发现DTL通过WD40结构域与PDCD4结合。4.免疫共沉淀实验证明PDCD4与CIL4A存在相互结合,且与CUL4A的结合依赖DTL。5.Western blot和qRT-PCR实验证明DTL高表达导致PDCD4蛋白水平降低,DTL低表达导致PDCD4蛋白水平升高,但对其mRNA水平变化无明显影响。6.在乳腺癌组织中,DTL与PDCD4表达水平呈负相关。7.对细胞进行蛋白酶体抑制剂MG132处理,发现MG132能阻断DTL对PDCD4降解。CHX与MG132联合作用证明泛素化途径在PDCD4降解中存在重要意义。8.在CHX作用下,高表达DTL能显著缩短PDCD4半衰期。9.PDCD4蛋白第67位丝氨酸在DTL对其结合和降解的过程中具有重要作用。10.DTL促进PDCD4的泛素化水平。11.敲低PDCD4能够弥补DTL下调导致的细胞增殖、迁移和侵袭能力缺陷。12.DTL激活JNK通路,抑制JNK通路抑制了 DTL对乳腺癌的促进作用。[结论]1.DTL与PDCD4存在相互作用。2.DTL通过泛素化途径降解PDCD4。3.PDCD4能够弥补DTL敲低造成的细胞增殖、侵袭迁移能力的降低。