草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，一直以来是中国大部分地区的主养品种，在我国农业经济中具有重要的意义。由于高密度养殖以及水质环境的日益恶化，草鱼养殖过程病害的发生日趋严重，其中嗜水气单胞菌所致的草鱼败血病是危害最大的细菌性疾病之一.本研究采用传统理化鉴定方法与分子生物学鉴定方法，对患病草鱼的嗜水气单胞菌分离株进行分类鉴定，并进行其毒力基因的鉴定。同时研制重组嗜水气单胞菌的外膜蛋白W，为草鱼败血病基因工程业单位疫苗的制备提供理论依据。　　 1.草鱼嗜水气单胞菌的分离与鉴定　　 本研究从患暴发性败血病的草鱼肝脏病灶处分离了2株致病菌，分别命名为Wp3和Zcl，通过人工回归感染实验显示分离菌株能使草鱼致病死亡。对分离菌株进行形态观察、选择性培养基培养和理化特性分析，初步判定所分离的2株菌均为嗜水气单胞菌。进一步对菌株进行DNA分子鉴定，结果显示2株菌的16SrRNA基因、促旋酶亚单位蛋白(gryB)基因均与GenBank上的嗜水气单胞菌相应的基因具有高度的同源性。在根据已知序列构建的分子系统进化树中2株菌均与嗜水气单胞菌聚类。同时2个菌株均可扩增到气溶素基因(aerA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，提示它们均可能为嗜水气单胞菌强毒株。　　 2.嗜水气单胞菌毒力因子基因的分析　　 选取Wp3菌株，克隆该菌株的气溶素(aerolysin，aerA)基因和溶血素(hemolysin，h1yA)基因，序列分析显示这二个基因只有46.7％的同源性。B1ast分析显示，h1yA基因与GenBank上已登录的h1yA序列具有较高的同源性，而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些h1yA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些h1yA序列进行结构域预测，发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域，说明它们实际上应是aerA基因，只是命名上与h1yA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和h1yA的抗原区，显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和h1yA基因，结果显示二株毒力株均有特异条带，而无毒株则未扩增到特异条带，说明aerA和h1yA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。　　 3.重组外膜蛋白W的制备　　 以Wp3菌株基因组DNA作为模板扩增外膜蛋白W基因(OmpW)。OmpW基因全长为865bp，其中开放式阅读框(ORF)为615bp，与标准株ATCC7966的OmpW基因的同源性高达99.8％。使用蛋白结构分析软件对该ORF框编码的蛋白高级结构进行预测，发现其编码的蛋白质具有一个由8个β折叠组成的结构域。根据ORF序列设计引物进行扩增，将不含信号肽的OmpW基因编码序列克隆到表达载体pQE30中，转化至大肠杆菌M15，经诱导可表达分子量大小为24.7kDa的带外膜蛋白与his标签的融合蛋白His-W。　　 4.重组蛋白免疫原性与保护作用评价　　 融合蛋白His-W经过镍柱纯化后，对草鱼进行免疫实验。受免草鱼血清经Elisa分析显示呈现阳性反应，说明重组蛋白能诱导产生特异性抗体。采用实时荧光定量PCR方法分析诱导前后草鱼头肾组织IgM基因表达水平的变化，结果显示免疫组IgM的表达量均高于空白组，低浓度免疫组的表达量显著高于空白组的(p＜0.05)，说明所表达的融合蛋白His-W可使草鱼产生良好的免疫应答并诱导产生高效抗体。保护性实验显示，免疫组获得较高保护率(57％～86％)。本研究结果显示嗜水气单胞菌外膜蛋白W基因可作为草鱼嗜水气单胞菌疫苗的候选基因。