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背景及目的蛋白尿是导致肾脏纤维化发生的独立因素,也是糖尿病肾病(DN)进展的重要因素。课题组前期研究表明:“精损络痹”(即肾精亏虚、瘀浊内生)是糖尿病肾病蛋白尿的核心病机,针对这一病机,我们提出填精通络的治疗方法,且在前期实验研究中发现,填精通络法指导下的芪地糖肾颗粒可以降低DN大鼠尿蛋白(P<0.05),但其机制尚不明确。转化生长因子β(TGF-β)是纤维化发生的重要因子,在DN过程中,它可以通过多种通路诱导肾脏纤维化,其中TGF-β1-Smad2/3是最经典通路。因此,本研究目的在于通过实验研究探讨芪地糖肾颗粒对TGF-β1-Smad2/3通路中的纤维化因子TGF-β 1、Smad2、Smad3的影响;通过临床研究探讨纤维化因子TGF-β、Smad2、Smad3与肾虚证、血瘀证、痰浊证的相关性。方法实验研究采用单次腹腔注射STZ 55mg/kg制造1型糖尿病大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为6组,分别为对照组、模型组、芪地糖肾颗粒高、中、低剂量组以及西药缬沙坦(商品名代文)组。各组大鼠分笼饲养,自由饮食进水,按照体重喂以同容积的药物。模型组和正常对照组分别给予等剂量的羧甲基纤维素(CMC)灌胃;芪地糖肾颗粒高、中、低剂量组用CMC以5.24g/kg体重、2.62g/kg体重和1.31g/kg体重的浓度配制成三种不同浓度的药液给药;代文组按8mg/kg体重给药,给药治疗12周。于0、2、4、6、8、10、12周检测大鼠血糖及体重;给药前及给药后的每4周留取大鼠24h尿液,检测24h尿微量白蛋白定量;给药第12周末取材,检测各大鼠血肌酐(Scr)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。HE染色光镜观察各大鼠肾脏病理改变,Masson染色光镜观察肾小管及间质病理改变。Western-Blot方法检测大鼠肾组织TGF-β1、Smad2、Smad3、a-SMA蛋白表达。临床研究依托课题“糖尿病肾病早期预测诊断决策树的建立与验证”(课题编号:JD2X2015305)入组符合糖尿病诊断标准的患者56例,收集入组患者的一般资料及理化结果,根据中医证素辨证表将患者进行中医证素辨证,根据尿微量白蛋白/尿肌酐(ACR)值将入组患者分为单纯糖尿病(DM)组和糖尿病肾脏病(DKD)组,用Elisa方法检测上述患者血清TGF-β1、Smad2、Smad3表达水平。分别比较DM组和DKD组患者一般资料和血清TGF β1、Smad2、Smad3表达水平的差异;探讨纤维化因子TGF-β 1、Smmad2、Smad3的表达水平与DKD组肾虚证、痰浊证、血瘀证的相关性。结果实验研究1一般理化检查1.1大鼠肾指数(肾重/体重):与对照组相比,模型组肾指数明显升高(P<0.01)与模型组相比,各给药组肾指数未见明显差异(P>0.05)1.2血糖:与对照组相比,模型组血糖明显升高(P<0.01);与模型组相比,在给药第12周时,芪地糖肾颗粒中剂量组血糖水平降低(P<0.05)1.3血脂及肝功:与对照组相比,模型组TG、CHO、ALT、AST水平均无差异(P>0.05);与模型组相比,芪地糖肾颗粒高剂量组TG水平降低(P<0.05),CHO、ALT、AST水平未见差异(P>0.05)1.4肾功:与对照组相比,模型组Scr水平未见差异(P>0.05)。2疗效指标24h尿微量白蛋白:与对照组相比,模型组24h尿微量白蛋白水平明显升高(P<0.01);与模型组相比,在给药第12周时,芪地糖肾颗粒高、中、低剂量组24h尿微量白蛋白水平明显降低(P<0.01);与阳性药物代文组相比,芪地糖肾颗粒高剂量组和中剂量组24h尿微量白蛋白水平较低(P<0.05)。3大鼠组织形态学改变3.1光镜下HE染色,与对照组相比,模型组个别肾脏的肾小球系膜基质增多或毛细血管基底膜增厚,肾小管病理性改变,见小管上皮细胞胞浆空亮、呈空格样,肾小管上皮细胞空泡变性,肾小管上皮细胞肥大伴扩张、或有脱落和管腔内蛋白小滴,皮质浅层肾小管扩张;与模型组相比,芪地糖肾颗粒剂中、低剂量组动物肾脏肾小管上皮细胞胞浆空亮、呈空格样病变发生率有降低,且中剂量组动物肾脏病变发生率降低更为明显,病变程度亦有降低;芪地糖肾颗粒高剂量组动物肾脏病变发生率虽无降低,但病变程度有明显降低。3.2光镜下Masson染色肾脏组织切片的胶原纤维染色均未见明显异常,与对照组相比,模型组未见肾小球及间质纤维增生。4 Western-Blot法检测肾组织内TGF-B1、Smad2、Smad3、a-SMA的表达水的水平与对照组相比,模型组TGF-B1、Smad2、Smad3表达水平升高(P<0.05);与模型组相比,芪地糖肾颗粒的高剂量组TGF-B1的水平明显降低(P<0.01),中剂量组TGF-B,的水平降低(P<0.05);低剂量组的TGF-B1的水平无明显差异(P>0.05);各给药组的Smad2、Smad3、a-SMA表达水平无明显差异(P>0.05)。临床研究1 DM组与DKD组患者的年龄及理化检查水平未见统计学差异(P>0.05)。2与DM组相比,DKD组患者血清的TGF-β1、Smmad2表达水升高(P<0.05)。3 DKD组患者血清TGF-β1、Smad2的表达水平与痰浊证、血瘀证、湿热证相关(P<0.05);TGF-β 1的表达水平与肾阳虚证相关(P<0.05);Smad2的表达水平与肾阳虚证未见相关性(P>0.05);TGF-β1、Smad2的表达水平与肾阴虚证、肾气虚证未见相关性(P>0.05)。结论实验研究1芪地糖肾颗粒可以降低糖尿病肾病大鼠的血糖、甘油三酯以及尿蛋白水平。2芪地糖肾颗粒通过TGF-β1-Smad2 3通路下调TGF-β 1的表达水平来对糖尿病肾病的纤维化产生防治作用;未见对Smad2、Smad3的表达水平产生影响。临床研究纤维化因子TGF-β1、Smad2与DKD患者的痰浊证、血瘀证以及肾阳虚证相关。