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干扰素γ诱导蛋白10基因与肿瘤抗原修饰树突状细胞抗前列腺癌实验研究 目的： 1．构建干扰素γ诱导蛋白10(IFN-γ inducible protein-10, IP-10)真核表达质粒(IP-10／pcDNA3.1)并大量制备。 2．建立从小鼠骨髓前体细胞中分离、培养和扩增树突状细胞(dendritic cell, DC)的方法；研究DC发育、分化和成熟过程中形态、结构以及免疫生物学特性的改变；探讨影响DC增殖、分化的有关因素。 3．将RM-1前列腺癌细胞的裂解产物(Lysate)和IP-10基因共同修饰DC，构建前列腺癌DC瘤苗(IP-10／Lysate-DC)；体内、外实验检测该瘤苗抗前列腺癌免疫治疗作用及免疫保护作用。 方法： 提取小鼠脾脏总RNA，逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增小鼠IP-10基因并加上信号肽基因序列后，克隆至pcDNA3.1(+)质粒，构建IP-10／pcDNA3.1表达载体并转化、抽提和纯化。分离骨髓前体细胞，在细胞因子GM-CSF和IL-4联合作用下，经手法筛选，大量制备骨髓DC(bone marrow derived DC, BM-DC)。采用形态学(光镜、电镜)、免疫细胞化学(FCM)以及免疫生物学(MLR)等方法研究DC的生物免疫学特性。将RM-1前列腺癌细胞的裂解产物负载DC后，通过脂质体转染法将IP-10基因导入DC，制备IP-10／Lysate-DC前列腺癌瘤苗；RT-PCR和Western blot检测转染DC IP-10的表达，测定转染DC上清对T细胞的趋化指数，检测DC瘤苗刺激T细胞的增殖以及诱导特异性CTL的杀伤作用。建立小鼠RM-1前列腺癌模型，观察该瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用；预先应用瘤苗接种小鼠后，以RM-1细胞攻击小鼠，观察瘤苗诱导的免疫保护作用；ELISA方法检测接种DC瘤苗小鼠CTL的IL-2和IFN-γ表达水平。 结果： 1．所构建的IP-10／pcDNA3.1表达质粒，经酶切电泳和DNA正、反向测序鉴定，证实重组质粒构建正确，插入片断包含IP-10基因序列和单核细胞趋化蛋白1信号肽基因序列。 2．在细胞因子GM-CSF或GM-CSF加IL-4诱导下，体外培养7天后，可从每中文摘要 只小鼠的骨髓前体细胞中获得5一10xl护个Dc。形态学观察可见，培养早 期的DC突起少而短，胞内有许多囊泡，细胞器少;细胞表面低表达B7分子 和MHC分子，刺激T细胞增殖能力极弱，但吞噬能力强;培养7天时，细 胞呈现典型的DC形态，表面伸出许多树枝样突起，胞内囊泡结构减少，细 胞器成分增加，吞噬功能减弱，但B7分子和MHC分子表达明显上调，能强 烈刺激T细胞增殖。GM一CSF加IL一4组的DC得率及细胞功能均明显高于 GM一CSF组。3.将RNI一1前列腺癌细胞的裂解产物负载培养5天后的DC，通过DOI人P脂质 体转染法可以成功的将IP一10基因导入Dc，构建IP一10/Lysate一DC前列腺癌 瘤苗;经RpPCR和M尾Stem blot检测证实转染DC的IP一10 mRNA和蛋白表 达明显增强，其细胞上清对T淋巴细胞有显著趋化作用。4.混合淋巴细胞反应显示，IP一10/Lysate一DC瘤苗刺激同基因型小鼠脾脏T细胞 增殖能力明显提高。四氮吟蓝(MTT)还原法检测显示，用负载RM一1细胞 裂解产物的DC(Lysate一DC)免疫小鼠，其脾脏T细胞经RM一1细胞诱导后， 对RM一1肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，但杀伤作用明显低于IP一10/切sate一DC 免疫组小鼠，差异有显著性意义(p<0.01)。5.RM一1前列腺癌荷瘤小鼠模型构建成功，成瘤率为100%。体内实验显示， Lysate一DC治疗组小鼠肿瘤生长减慢，生存期延长;应用IP一10/切sate一Dc的 治疗作用较切sate一DC进一步增强，接种RM一1肿瘤细胞75天后， IP一10/Lysate一Dc治疗组仍有50%的小鼠存活，差异有显著性意义(p<0 .01)。6，组织学检查发现，经IP一10/Lysate一DC瘤苗治疗的小鼠，肿瘤组织局部坏死明 显，在瘤体周围和瘤体内有大量炎细胞浸润，切sate一DC治疗组也可见较明显 的炎细胞浸润，但少于IP一10/Ly sate一Dc组。7.免疫保护实验发现，经IP一10/Lysate一DC免疫的小鼠接种R人1一1肿瘤细胞后， 肿瘤生长缓慢，小鼠生存期延长，在RM一1细胞攻击后75天，经 lP一10/切sate一DC免疫的小鼠仍有67%无肿瘤生长;Lysate一DC也具有免疫保 护作用，但明显弱于IP一10/Lysate一DC，免疫小鼠只有17%无肿瘤生长，差异 有显著性意义(p<0 .05)。8.ELISA检测显示，经IP一10/场sate一DC免疫的小鼠，其CTL的IL一2和IFN一Y 表达水平明显升高，与Lysate一DC免疫小鼠相比，差异有显著性意义(p<0.05)。结论:1.所构建的IP一1帅cDNA3.1表达质粒正确。2.小鼠骨髓单个核细胞在细胞因子GM一CSF和IL一4诱导下，通过手法筛选，能中文摘要 扩增获得大量功能性DC。GM一CSF是DC生长的必须因子，GM一CSF和IL一4 联合应用，可增加DC的得率，增强DC的免疫功能。3.通过脂质体转染法将IP一10/P cDNA3.1导入DC，获得有效的IP一10表达，转 染DC的上清对T淋巴细胞有显著趋化作用。4，RM一1前列腺癌细胞裂解产物和IP一10基因共同修饰DC所构建的前列腺癌 Dc瘤苗(IP一10/切sate一DC)，能够明显刺激T细胞的增殖，所诱导的特异性 cTL分泌IL一2和IFN一Y能力增强，对RM一1细胞具有显著杀伤作用。5.将IP一10/Lysate一Dc瘤苗回?