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目的:脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,其中脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelium cell,BMEC)损伤占据中心地位。课题组前期研究结果显示,在整体动物实验水平上,天麻酚性成分可有效对抗缺血再灌注损伤,机制与抗炎、内皮性依赖舒张血管有关,提示天麻有效成分可能是通过抗炎,激活PI3K/AKt信号通路而发挥作用。本研究复制细胞缺糖缺氧/复糖复氧(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/Rep)模型,检测细胞存活率、LDH、NO、炎症介质、紧密连接(Tight junction,TJ)标志性蛋白、基质金属蛋白酶的表达,明确天麻酚性成分保护作用机制,并检测PI3K/AKt信号通路相关因子,在分子水平上进一步明确脑保护机制是否与PI3K/AKt信号通路的激活有关。方法:1.天麻酚性成分对OGD/Rep损伤b End.3细胞模型的保护作用研究1.1采用三气培养箱造成OGD/Rep损伤模型,用MTT法测定b End.3细胞存活率,选择存活率50%-60%作为造模条件。1.2复制细胞OGD/Rep损伤模型,用MTT法测定b End.3细胞存活率,检测天麻酚性成分对OGD/Rep损伤模型是否有保护作用。用免疫荧光法检测天麻酚性成分对occludin、claudin-5蛋白的影响。用试剂盒检测天麻酚性成分对NO、LDH的影响。用荧光定量PCR检测天麻酚性成分对MMP-2/9的影响。2.天麻酚性成分对OGD/Rep损伤b End.3细胞模型炎症介质的影响复制细胞OGD/Rep损伤模型,用试剂盒检测天麻酚性成分对TNF-α、IL-6、IL-1β的影响。3.天麻酚性成分对OGD/Rep损伤b End.3细胞PI3K/AKt信号通路的影响复制细胞OGD/Rep损伤模型,用western bolt检测PI3K/AKt信号通路相关因子(e NOS、p-e NOS、AKt、p-AKt),探讨天麻酚性成分对PI3K/AKt信号通路的影响。结果:1.天麻酚性成分对OGD/Rep损伤b End.3细胞模型有保护作用1.1造模后,细胞存活率下降,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。OGD 6 h/Rep 4h细胞存活率是(56.95±1.99)%,作为后续实验造模条件。1.2 C、D、H成分可提高细胞存活率(P<0.05或P<0.01)。B、C、D成分可提高occludin及claudin-5蛋白表达(P<0.05或P<0.01);H成分可提高occludin蛋白表达(P<0.01)。B成分可升高NO表达(P<0.01);B、C、D、H成分可降低LDH(P<0.05或P<0.01)。B、C、D、H成分能升高MMP-2 m RNA表达(P<0.01)。2.天麻酚性成分对OGD/Rep损伤b End.3细胞模型炎症介质的影响B、C、D成分可降低IL-6、IL-1β表达(P<0.05或P<0.01)。3.采用western bolt检测PI3K/AKt信号通路相关因子(e NOS、p-e NOS、AKt、p-AKt),探讨天麻酚性成分对PI3K/AKt信号通路的影响。天麻酚性成分C在抑制剂处理前后,AKt、e NOS蛋白表达差异无统计学意义,而p-AKt/AKt,p-e NOS/e NOS比值分别升高和下降(P<0.05或P<0.01)。结论:1.天麻酚性成分C、D、H可提高细胞存活率,减轻b End.3细胞OGD/Rep损伤。保护机制与提高细胞TJ蛋白(occludin、claudin-5)的表达,减轻细胞膜受损情况,促进NO的释放有关。2.天麻酚性成分C对抗OGD/Rep损伤与激活PI3K/AKt信号通路有关。