目的近年来,以生长因子,种子细胞和载体支架为基础的组织工程的研究已经取得了很大进展,然而在临床应用方面的效果却并不理想。究其原因,很大程度上是因为移植物血管网缺乏,血液供应不足而造成的细胞营养供应障碍。以往的研究证实,种子细胞的存活范围在血供弥散的150-200μm内。如果组织工程移植物的血管化问题不能解决,具有较大体积的组织工程移植物的临床应用就难以实现。最近用各种血管生长因子及其转基因技术促进组织工程移植物血管新生的作用有很多报道。但由于多种血管生长因子本身的局限性及转基因治疗中尚存在许多问题,使其在临床上的应用受到了限制,所以寻找以诱导血管新生为基点的方便、有效、实用的药物来促进组织工程移植物的血管生长具有重要的临床意义,是组织工程学研究的一个热点。他汀类药物作为HMG-CoA还原酶抑制剂,是临床常用的降血脂药。体外的血管新生共培养实验表明,阿托伐他汀具有促血管样结构形成的作用。如果阿托伐他汀能做为促血管新生药物用于组织工程移植物中,将会为组织工程移植物的血管化带来新的希望。本实验将Ⅰ型胶原蛋白支架植入大鼠皮下,用阿托伐他汀对实验大鼠进行灌胃,通过观察Ⅰ型胶原蛋白支架中VEGF、CD34的阳性细胞、血管样结构及VEGFmRNA的表达,来探讨阿托伐他汀是否能作为促血管新生药物促进组织工程移植物的血管化。方法1、Ⅰ型胶原蛋白支架的形态学观察(1)伊红染色:长宽高各5mm的Ⅰ型胶原蛋白支架一块,置入冷冻包埋剂中,掖氮速冻后行连续冰冻切片,厚度为8μm。切片置入4%多聚甲醛中固定30min,流水冲洗后行常规伊红染色,光学显微镜下采集图像。(2)扫描电镜:长宽高各5mm的Ⅰ型胶原蛋白支架一块,用2.5%戊二醛固定,梯度乙醇脱水,临界点干燥,喷金,扫描电镜观察并采集图像。2、Ⅰ型胶原蛋白支架的体内植入及分组取Wistar大鼠(40只),雌雄不限,体重90-100g,在双侧大腿背侧中点皮下植入体积为125mm~3的Ⅰ型胶原蛋白支架。手术后随机分为实验组(20只)和对照组(20只)。3、应用阿托伐他汀灌胃从术后第1d开始,实验组大鼠给予阿托伐他汀溶液灌胃(1mg/kg),对照组大鼠则给予等量生理盐水做对照,每曰一次。术后第14d处死大鼠,取出植入的Ⅰ型胶原蛋白支架。一部分置入冷冻包埋剂中,液氮速冻后于-70℃冰箱冷冻保存,以备做免疫组织化学分析;另一部分置入Trizol试剂中,-70℃冰箱冷冻保存,以备做RT-PCR检测。4、免疫组织化学染色将-70℃冰箱冷冻保存的冷冻包埋剂中的Ⅰ型胶原蛋白支架行连续冰冻切片,厚度为8μm。切片分别进行VEGF抗体和CD34抗体免疫组织化学染色,光学显微镜下采集图象。5、RT-PCR检测用RT-PCR检测术后第14d两组大鼠Ⅰ型胶原蛋白支架中VEGFmRNA的表达情况。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:150V,30min),Tanon凝胶电泳图像分析系统扫描电泳条带。6、统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析。结果1、Ⅰ型胶原蛋白支架形态学观察结果(1)伊红染色可见,Ⅰ型胶原蛋白支架被染成红色,结构疏松,具有典型的多孔结构,孔径大小150-200μm。(2)扫描电镜观察,Ⅰ型胶原蛋白支架表面光滑,有少许皱褶形成。2、术后大鼠一般情况及切口愈合的观察结果术后1小时,大鼠清醒,活动较好,正常进食饮水,大腿背部的切口干燥整齐。以后体重逐渐增加,至术后第14d,两组大鼠切口均愈合良好,未见感染。3、免疫组织化学染色结果CD34阳性细胞多位于支架边缘部分,棕黄色阳性颗粒均匀的分散于胞膜中,阳性细胞多形成管径为6-10μm的毛细血管样结构。实验组(图2)阳性细胞较对照组多。VEGF染色可见棕黄色颗粒沉淀于细胞质或细胞外基质中。阳性表达部位未见毛细血管样结构形成,周围可见散在的红细胞存在。实验组阳性表达部位较对照组多。4、RT-PCR检测结果实验组VEGFmRNA的表达明显较对照组高。5、统计学分析实验组CD34、VEGF和VEGFmRNA的表达均较对照组高,P<0.05,差异具有统计学意义。结论阿托伐他汀可以上调大鼠体内Ⅰ型胶原蛋白支架中VEGFmRNA的表达,刺激VEGF的分泌,增加CD34阳性细胞数量及CD34阳性细胞构成的血管样结构。