论文部分内容阅读
2型糖尿病(2-DM)是一种常见的严重危害人类健康的慢性终身性疾病。近年研究发现,2型糖尿病患者红细胞(RBC)免疫功能低下,且与病程及并发症的发生、发展相关。然而对2型糖尿病引起红细胞免疫功能下降的原因,是继发性因素还是原发性因素或二者共同作用所致,一直存有争议。第一补体受体(CR1)是红细胞膜上主要的免疫相关物质,其数量由常染色体共显性遗传决定,通过红细胞CR1密度相关基因来表达。目前国外对1型糖尿病与红细胞CR1密度相关基因多态性的关系作过一些研究,然而对2型糖尿病患者红细胞CR1密度相关基因多态性的研究,国内外尚无人涉及。本研究采用PCR和Hind Ⅲ内切酶酶切技术及红细胞免疫粘附花环试验,对2型郑州人,Z20贴年叭究生论义2型糖尿病红细胞免疫功能及* 基因多态性糖尿炳患者进行1*病例-对照研究,以观察2型糖尿病患者红细胞免疫功能及红细胞CRI密度相关基因型的频率分布,并探讨可能的发病机制。 检测对象及血样的采集 2型糖尿病患者组56例,男26仔,女30例,年龄52.84士 5.43岁;对照组 56例,男 26例,女 30例,年龄53.39 5.22岁。两组性别、年龄无显著性差异(P>0.05) 清晨空腹采集检测对象全血 Zml,lmIEDTA七。抗凝,-20OC保存备抽提 DNA;lml肝素抗凝,4h内完成红细胞免疫功自试验。 实验方洁 1.红细胞CRI密度相关基因多态性的测定: 山提取DNA:取冻存的EDTA抗凝血,室温下融解,加灭菌双蒸水洗涤破坏红细胞,5000rpm离心smin,弃上清,重复操作一次,收集白细胞,常规提取DNA; (2)扩增:总反应休系30山,PCR反应试剂及其量如下:弓物 1*卜mol/L、dNTPs 200 pmollL、模板DNA 3 卜扩增缓冲液若干,最后用石蜡油加…封闭。置入FR习00PcR循环扩增仪中,94 oC预变性 240秒,94 C变性 60秒,55 C退火 50秒,72 C延伸 50秒,循环 30次,最后 72 OC延伸 300秒; 一2 一郑州人学2002年川叽生论义2型糖尿病红驯胞免疫功能及Cm基闪多态。叮 (3)取扩增产物 5 pl,澳乙锭汇B)染色,1%琼脂糖凝胶板上点样,电泳,紫外灯下观察扩增是否成功; m酶切:取扩增产物 14 pl,加入缓冲液 2 pl,牛血清白蛋白(BSA)0.2 pl,Hind Ill酶 lpl 禾灭菌双蒸水 28pl,放入37*恒温箱 1.sh 乃)结果判断:取 10 UI酶切反应液和 Marker 5 pl,在 1%琼脂糖凝胶点样,EB染色电泳,紫外箱观察结果。扩增产物只有1.8 kb一条带者为高表达卜H)型;有 1.8 kb、1.3 kb禾 0.5 kb三条带者为中表达卜L)型;有 1.3 kb和 0.5 kb两条带者为低表达(L)型。 2.红细胞兔疫粘附花环试验: n取肝素抗凝血,用生理盐水洗涤,离心弃上清,再加入生理盐水,调整红细胞数为 1.25x’个lml; (2)取致敏酵母菌诽致敏酵母菌冻干粉各一支,加少量生理盐水,于 37 C水浴中溶解,洗涤,离心弃上清,分别加牛理盐水调整酵母菌浓度为 1刀X10’个加l; 间取2支试管加入待测红细胞悬液各50 p;,试管1加入致敏酵母悬液50 pl,试管2加入非致敏酵母菌悬液50 pl,充分混匀,放入37℃水浴30min,取出后在每个试管里加入4滴生理盐水和 1滴0.25%戊二醛后摇匀,用吸管取半量在玻片上涂成薄膜,加甲醇固定后瑞氏染色; 3 一郑州人学m02年研究生论义2型糖尿病红细胞免疫功能及Cm基因多态性 (4)花环计数,在高倍镜下计数200个红细胞,1个红细胞粘附2个或2个以上酵母菌者为1个花环,管1计数红细胞C3b受体花环,管2计数红细胞免疫复合物花环。 (5)计算红细胞花环率 红细胞花环率=孜妊缀 XI 00% 200 结 果 1.两组人群的红细胞CRI基因型构成比及基因突变率的比较: 2型糖尿病组的HH型为57 14%、HL型为3750%,LL型为5.36%;对照组的HH型为67.86%、HL型为28.53%,LL型为 3.57o。两组比较,基因型构成比无显著性差异(尸>口*5)。 2型糖尿病组的基因突变率为42.86%*4历6),对照组为32.14o门历6)。两组比较,也无显著性差异(P>0.05)。 2.两组人群红细胞CRI基因型的红细胞C3b受体花环率(RBC-C3bR)比较: 2 型糖尿病组的 HH 型为 16,81 IS.790、HL 型为11.88士2.39%;对照组的 HH型为 26*9士6.23%,HL型为21。34士6.64o。两组中HH型的RBC-C3bR均高于HL型(尸<0刀1)。 一4 一郑州人学2002年研火生论文2型糖尿病红驯胞免疫功能及cm基1%多态性 3.两组人群红细胞CRI基因型的红细胞兔疫复合物花环率(RBC-CICR)比较: 2 型糖尿病组HH 型为7.47士2.04o,HL 型为10.60?