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目的:初步探索多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)患者骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)通过PD-1/PD-L1轴对骨髓CD8~+T淋巴细胞功能的调节,为进一步寻找MM免疫治疗新靶点提供依据。内容:体外诱导培养正常对照者(NC)和初治多发性骨髓瘤(NDMM)患者BMSCs,应用流式细胞术(FCM)检测BMSCs表面PD-L1表达水平,同时检测NC及NDMM患者骨髓各淋巴亚群(NK细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞)表面PD-1的表达情况,比较BMSCs表面PD-L1表达率及各淋巴细胞亚群PD-1率在两组之间表达水平差异。体外构建BMSCs与CD8~+T淋巴细胞共培养体系,分为3组(A组:CD8~+T细胞组;B组:CD8~+T细胞+BMSCs组;C组:CD8~+T细胞+BMSCs+PD-L1抑制剂组),共培养72h后比较3组之间CD8~+T淋巴细胞数量、功能的差异,进一步明确PD-1/PD-L1轴在BMSCs对CD8~+T淋巴细胞免疫调节中的作用。最后,在体外CD8~+T淋巴细胞与BMSCs共培养体系中,分别以PD-L1抑制剂、免疫调节剂泊马度胺以及两者联合干预,观察不同组作用后CD8~+T淋巴细胞对MM细胞系U266的杀伤情况。方法:1.NC及NDMM患者BMSCs表面PD-L1表达水平:体外诱导NC及NDMM患者骨髓单个核细胞形成BMSCs,观察其形态及数量,应用FCM检测其表面分子标记(CD45、CD34、CD90、CD105、CD73)并测定其纯度。进而应用FCM检测BMSCs表面PD-L1表达水平,比较NC及NDMM组PD-L1表达水平差异。2.NC及NDMM患者骨髓各淋巴细胞亚群(NK细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞)表面PD-1表达情况:应用FCM分别检测NC及NDMM患者骨髓NK细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞表面PD-1表达情况,比较三种细胞PD-1表达水平在两组间的差异。3.体外细胞水平探讨BMSCs对CD8~+T淋巴细胞功能的调节作用:体外诱导NDMM患者骨髓单个核细胞形成BMSCs,待第3代BMSCs成熟约14天左右;同时配对分选CD8~+T细胞,使用CD3 CD28耦合刺激因子体外刺激培养14天;14天后建立BMSCs与CD8~+T淋巴细胞共培养体系。以CD8~+T淋巴细胞单独培养组为A组,同时将BMSCs与CD8~+T共培养体系分为2组(B、C组),B组:CD8~+T细胞与BMSCs共培养,无PD-L1抑制剂干预;C组:CD8~+T细胞与BMSCs共培养,加入PD-L1抑制剂干预;每组BMSCs/CD8~+T细胞比率为1:5。共培养72h后FCM检测3组培养体系CD8~+T淋巴细胞凋亡率及穿孔素、颗粒酶-B表达水平。4.体外诱导BMSCs与CD8~+T细胞共培养体系,分为A、B、C、D 4组(A组:空白对照组;B组:PD-L1抑制剂干预组;C组:泊马度胺干预组;D组:PD-L1抑制剂联合泊马度胺干预组),72h后提取分离4组共培养体系中上层悬浮细胞即为CD8~+T细胞(BMSCs为贴壁细胞),并与MM细胞系U266共培养,以CD8~+T细胞/MM细胞比例为1:1比率建立共培养体系,共培养72h后应用FCM检测U266的凋亡率,比较4组CD8~+T细胞对MM细胞U266杀伤能力的差异。结果:1.NDMM组BMSCs较NC组形态及数量未见差异,BMSCs纯度可达95%以上,NDMM组BMSCs表面PD-L1表达率(18.81±1.61)%较NC组(2.78±0.70)%明显增高(p<0.001)。2.NDMM组CD8~+T细胞表面PD-1表达率(43.22±2.98)%较NC组(20.71±1.08)%显著增高(p<0.001),而NK细胞、CD4~+T细胞表面PD-1表达率在两组之间未见差异(p>0.05)。3.体外共培养体系中,CD8~+T淋巴细胞凋亡率(%)在A、B、C三组均有显著差异(22.30±0.95 vs.57.44±1.70 vs.34.53±1.21,p<0.001);CD8~+T细胞穿孔素表达量(%)在A、B、C三组间有显著差异(91.66±1.36 vs.63.10±2.46 vs.80.10±1.21,p<0.001);CD8~+T细胞颗粒酶-B表达量(%)在A、B、C三组均有显著差异(73.75±1.31 vs.43.36±1.50 vs.59.75±1.66,p<0.001)。提示PD-L1抑制剂作用于共培养体系后,可降低BMSCs介导的CD8~+T细胞凋亡,阻断BMSCs对CD8~+T淋巴细胞穿孔素及颗粒酶-B生成的抑制。4.四组共培养体系中,PD-L1抑制剂联合泊马度胺组MM细胞系U266凋亡率(32.93±0.74)%较单独干预PD-L1抑制剂组(21.22±0.94)%、单独干预泊马度胺组(20.39±1.96)%及空白对照组MM细胞系U266凋亡率(9.58±0.94)%均显著增高(p<0.001),提示相比于单用PD-L1抑制剂或泊马度胺,两者联合可显著阻断BMSCs对CD8~+T淋巴细胞杀伤MM细胞的抑制作用。结论:1.NDMM组BMSCs表面PD-L1表达水平较NC组显著增高。2.NDMM组CD8~+T细胞表面PD-1表达率较NC组显著增高,而NK细胞、CD4~+T细胞表面PD-1表达率在两组之间未见差异。3.MM患者BMSCs可能通过PD-1/PD-L1轴诱导CD8~+T淋巴细胞凋亡,抑制CD8~+T淋巴细胞释放穿孔素及颗粒酶-B。4.PD-L1抑制剂联合泊马度胺较单用PD-L1抑制剂或泊马度胺显著阻断BMSCs对CD8~+T淋巴细胞杀伤MM细胞的抑制。