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微生物代谢产物一直是挖掘新型活性天然产物的宝贵资源。近年来,随着分子生物学及测序技术的发展,挖掘微生物代谢产物的新方法应运而生,如基于序列的靶向筛选法、底物诱导法等。这些挖掘方法,能够克服传统活性和化学筛选方法的缺陷,实现对特定种类活性天然产物的靶向挖掘。而且,对微生物代谢产物的研究已从可培养向不可培养延伸,即利用宏基因组学技术,绕开传统微生物的纯培养过程,直接提取环境DNA,在异源宿主中进行克隆表达,获得目的产物,实现对不可培养微生物的研究,为新型活性天然产物的挖掘提供了新资源、新方法和新途径。聚酮类化合物(polyketides)是一类由聚酮合酶(polyketide synthetic enzymes,PKSs)合成的化合物的总称,是迄今微生物代谢产物中最大的家族,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗结核、免疫抑制等多种生物活性,被广泛应用于食品、医药、工业等多个领域。随着抗生素的大量应用,细菌耐药性增加和多重耐药性致病菌的不断出现,迫切需要寻找和开发疗效显著而毒副作用小的新型先导化合物,特别是新型聚酮类化合物。本研究以聚酮类化合物合成酶编码基因中高度保守的酮基合成酶(KS)序列为靶点,采用基于序列的靶向筛选方法,获得含编码PKSs基因的目标菌株或基因序列,实现对可培养及不可培养微生物代谢产物的靶向挖掘。(1)可培养微生物的筛选与鉴定。以盐生海水蔬菜-海芦笋为研究对象,采用平板分离划线与纯化的方法,筛选其中的内生真菌,得到了4株宏观形态各不相同的菌株,分别编号为Salicorn 5、Salicorn 57、Salicorn 58及Salicorn 61。利用倒置光学显微镜及扫描电镜对菌株的形态进行观察,利用分子生物学鉴定方法,分别扩增菌株的内转录间隔区(ITS1+5.8S+ITS2)、核糖体大亚基(28S)的D1/D2区(LSU)、延伸因子EF-1α(elongation factor,tef)区,经测序及系统发育分析,将4株菌分别鉴定为Cunninghamella bigelovii、Penicillium chalabudae、Talaromyces funiculosus 及 Mucor hiemalis。其中,Salicorn 5是小克银汉霉属的一个新种,将其命名为Cbigelovii Z.Xin,Y.Zhao et H.Wang sp.nov.。该菌株具有高产脂肪酸的能力,经气相色谱分析,发现不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸的87%,其中,油酸占35.57%、亚油酸占21.58%、9-十六碳烯酸占16.31%、γ-亚麻酸占13.28%。(2)以KS序列为靶点,筛选含有目标序列的活性菌株。采用基于序列的靶向筛选法,通过PCR扩增目标基因、TA克隆、测序及系统发育分析,发现菌株Salicorn 58含有编码PKSs的基因,对该菌株进行发酵,利用有机试剂萃取和多种柱层析手段,从发酵产物中得到了 8个单体化合物。利用核磁共振、质谱、紫外可见光谱、红外光谱等现代波谱技术,将8个化合物分别鉴定为Tafuketide、N-(2’-hydroxy-3’-octadecenoyl)-9-methyl-4,8-sphingadienin、chrodrimanin A、chrodrimanin B、N-(4-羟基-2-甲氧基)乙酰胺、葡萄糖丁酯、3β,15β-dihydroxyl-(22E,24R)-ergosta-5,8(14),22-trien-7-dione及(3β,5a,8a 22E)-5,8-epidioxyergosta-6,22-dien-3-ol。其中,化合物 1 为新型聚酮类化合物,化合物2为新天然产物,其余为已知化合物。采用量子化学计算方法,确定了化合物3与4的绝对构型。(3)基于序列筛选,利用宏基因组技术筛选不可培养微生物中的目的基因序列。以土壤为研究对象,过筛除杂后,采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)裂解法,直接提取土壤中的DNA,纯化后经琼脂糖凝胶电泳检测,以柯斯质粒(cosmid)为载体,采用噬菌体封装侵染的方法,构建土壤环境DNA文库。以KS序列为靶点,PCR筛选测序后,经系统发育分析,得到含有PKSs的基因序列,依据这些序列设计特异性引物,采用96孔板梯度稀释法,回收得到含有这些序列的4个单克隆,分别编码为GA6-1、GA3-6、GA3-8N及GA3-12。对单克隆进行双末端测序分析,设计特异性引物,二次筛选,得到与单克隆GA6-1末端重叠的克隆子GA6-1-M13和GA6-1-T7。(4)目的基因序列的异源表达与产物鉴定。分别以大肠杆菌(Escherichia coli)和白色链霉菌(Streptomyces albus)为宿主,对筛选到的目的基因进行异源表达。将上述4个单克隆中包含的目的基因序列,分别电转导入E.coli BL21中,经高效液相色谱(HPLC)分析后发现表达产物中没有目标产物;将单克隆GA6-1和GA3-12中包含的目的基因序列分别用NotI和BamHI酶切后,利用转化偶联重组技术(transformation-associated recombination,TAR),在酵母中与捕获载体pTARa-GJ连接,得到重构质粒pTARa-GA6-1和pTARa-GA3-12,将重构质粒分别电转入E.coli EPI300中扩繁后,电转入E.coli S17-1,通过接合转移转入S.albus中表达,经HPLC分析后发现表达产物中没有目标产物;将单克隆GA3-6和GA3-8N中包含的目的基因序列分别用Psil酶切后,与经过DraI酶切后的质粒pOJ436连接,得到改造质粒pOJ436-GA3-6和pOJ436-GA3-8N,利用化学转化法分别转入E.coli XL10-Gold扩繁后,电转入E.coli S17-1,并转入S.albus中表达,经HPLC分析后发现表达产物中含有目标产物,但由于产物浓度过低而无法得到目标产物。利用TAR技术,将末端互相重叠的单克隆GA6-1、GA6-1-M13和GA6-1-T7在酵母中重组,得到重组基因序列GA6-M13,经琼脂糖凝胶电泳检测重组基因序列的长度为53.8 kb,经E.coli EPI300扩繁后,电转入E.coli S17-1,并于S.albus中表达,经HPLC分析后发现表达产物中没有目标产物;将重组基因序列GA6-M13电转入E.coli BL21,经HPLC分析发现表达产物中含有目标产物,将E.coli BL21/GA6-M13发酵后,利用有机试剂萃取和多种柱层析手段从发酵产物中分离得到3个单体化合物,利用现代波谱技术分别鉴定为环-(S-脯氨酸-S-苯丙氨酸)二肽、1-(对羟苯基)-甘油和反式-1-(对-羟苯基)-丁-1-烯-3-酮;将GA6-M13高通量测序后,通过antiSMASH分析,发现其中含有一个完整的聚酮/多肽杂合型生物合成基因簇,预测其能够合成由氨基酸和聚酮链所组成的化合物,与所分离的化合物结构并不一致,推测所得产物是该重组基因序列的中间产物或其衍生物。进一步分析发现中GA6-M13中含有一个AraC家族的正向转录调节因子,PCR扩增后双酶切连入含有强启动子T7的质粒pT28a(+)中,电转入含有GA6-M13的大肠杆菌BL21中,发酵10L后,从发酵产物中分离得到1个新的单体化合物,其结构与生物信息学预测的结构基本一致。(5)次级代谢产物的活性评价。分别采用铁离子还原能力(Ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)法、DPPH自由基清除法及ABTS自由基清除法对分离得到的化合物进行抗氧化活性评价,发现化合物1具有中等的ABTS自由基清除能力(半抑制浓度(IC50)为73.46±0.23μmol/L);化合物5具有强的ABTS自由基清除能力(IC50为11.43±1.61μmol/L)及中等的铁离子还原能力(FRAP值为187.52±2.97)。抑菌实验结果表明,化合物1、4和10对大肠杆菌具有抑制作用,其最小抑菌浓度(MIC)分别为18±0.40、43±0.52和65±0.28 μmol/L;化合物2对耻垢分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌和大肠杆菌具有广谱抑菌作用,MIC值分别为85±0.55、90±0.68、24±0.19和68±0.36 μmol/L;化合物3对金黄色葡萄球菌、四联球菌、草分枝杆菌和大肠杆菌具有广谱抑菌作用,MIC值分别为67±0.34、28±0.46、47±0.49和26±0.31μmol/L;化合物9对耻垢分枝杆菌及产气荚膜梭菌具有较强的抑制作用,MIC值分别为30 ± 0.35及23±0.46 μmol/L;化合物11对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有中等的抑制作用,MIC值分别为53±0.22和28±0.77μmol/L。该研究结果说明,以编码PKSs的基因序列为靶点可以实现靶向筛选,能够从可培养及不可培养微生物的代谢产物中挖掘到结构新颖、活性显著的聚酮类化合物,为寻找新型抗氧化剂和抗生素先导化合物提供了新的研究策略,拓展了微生物次级代谢产物研究的方法和途径。