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第一部分 ARHGEF7对HCCLM3细胞增殖与迁移侵袭能力的影响 研究背景和目的： 肝细胞癌（HCC）是最常见、高发的具有高度侵袭转移生物学特征的恶性肿瘤之一,近年研究表明其发生、发展与ARHGEF7有关。本课题组前期通过应用qRT-PCR、Western blot和IHC证实HCC组ARHGEF7在mRNA和蛋白质水平在组织表达明显高于相应癌旁肝组织和正常肝组织；前期还发现ARHGEF7在转移性肝癌细胞HCCLM3中mRNA和蛋白表达量均高于非转移性肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2，并成功构建抑制ARHGEF7表达的慢病毒载体(LV-ARHGEF7-RNAi)。本研究旨在从体外细胞层面研究ARHGEF7在肝癌细胞中的生物学功能，为后续体内实验以及ARHGEF7在HCC侵袭转移功能中的作用机制奠定基础。 方法： 1.感染复数及感染时间的确定：采用不同MOI值的空载体慢病毒LV-GFP-RNAi感染HCCLM3细胞，每24h在荧光显微镜下观察荧光细胞的数量，再通过qRT-PCR及Western blot检测其表达情况，选取最佳选取最佳MOI值及时间； 2.将筛选出来的HCCLM3细胞株分为三组：未转染组、LV-GFP-RNAi组及LV-ARHGEF7-RNAi组； 3.通过划痕实验检验三组细胞的迁移能力；通过Transwell检验三组细胞的侵袭功能；通过MTT法对细胞体外培养1-7天进行生长计数以及克隆形成实验检验三组细胞的增殖能力。 结果： 1.当MOI为5×105 v.g./cell转染72h时，荧光细胞数最多；与对照组相比，取该MOI值且感染72h时，ARHGEF7 mRNA及蛋白表达显著降低（P<0.01）； 2.划痕实验结果显示：LV-ARHGEF7-RNAi组的迁移能力较未转染慢病毒组及LV-GFP-RNAi明显下降； 3.Transwell显示：LV-ARHGEF7-RNAi组的侵袭能力较未转染慢病毒组及LV-GFP-RNAi明显下降； 4.MTT结果显示，与未转染慢病毒组及LV-GFP-RNAi组肝癌细胞相比细胞增殖无明显改变；同时细胞克隆形成实验结果同样提示三组细胞形成的集落数无明显差异。 结论： 抑制ARHGEF7的表达可抑制肝细胞癌的迁移、侵袭能力，但对肝癌细胞增殖能力无影响。 第二部分 ARHGEF7影响HCCLM3细胞生物功能的分子机制的探讨 研究背景和目的： Rho家族在细胞的一些基本功能中起着分子开关的作用。作为Rho亚家族的Rac1是细胞内重要的信号转导分子，有研究表明Rac1可通过磷酸化β-catenin S191和S605位点，促进β-catenin入核，从而激活Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因诱导肝癌的迁移和侵袭。而ARHGEF7同样在肝癌的发生发展过程中起着重要作用，可能调控着多条信号通路转导途径，但有关ARHGEF7和信号通路之间的研究尚不清楚，因此本研究重点探讨 ARHGEF7与Rac1的关系，以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响，初步探讨ARHGEF7影响HCCLM3细胞生物功能的作用机制。 方法： 1.qRT-PCR、Western blot法分别检测未转染组、LV-GFP-RNAi组及LV-ARHGEF7-RNAi组HCCLM3细胞中 GTP-Rac1及total-Rac1的mRNA及蛋白表达水平； 2.Western blot检测未转染组、LV-GFP-RNAi组及LV-ARHGEF7-RNAi组HCCLM3细胞中β-catenin及Wnt/β-catenin信号通路下游关键靶蛋白C-myc、Cyclin D1和MMP-7蛋白表达水平； 3.在未转染组、LV-GFP-RNAi组及LV-ARHGEF7-RNAi组HCCLM3细胞中加入Rac1激动剂FMLP后，Western blot检测细胞中β-catenin及Wnt/β-catenin信号通路下游关键靶蛋白C-myc、Cyclin D1和 MMP-7蛋白表达水平。 结果： 1.未转染组、LV-GFP-RNAi组及LV-ARHGEF7-RNAi三组HCCLM3细胞中total-Rac1 mRNA及蛋白水平无明显差异，但LV-ARHGEF7-RNAi组HCCLM3细胞中GTP-Rac1的mRNA及蛋白表达水平较未转染组、LV-GFP-RNAi组显著下调（P<0.01）； 2.LV-ARHGEF7-RNAi组 HCCLM3细胞中β-catenin及 Wnt/β-catenin信号通路下游关键靶蛋白C-myc、Cyclin D1和MMP-7蛋白表达水平较未转染组、LV-GFP-RNAi组显著下调（P<0.01）； 3.加入Rac1激动剂FMLP后，LV-ARHGEF7-RNAi组中β-catenin及Wnt/β-catenin信号通路下游关键靶蛋白C-myc、Cyclin D1和MMP-7蛋白表达水平显著提高（P<0.01）。 结论： ARHGEF7能通过活化Rac1激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进肝细胞癌的侵袭转移。