论文部分内容阅读
大蓟为菊科植物Cirsium japonicum DC.的干燥地上部分或根,为多年生草本植物,全国大部分地区均有分布。收载于2010版中国药典,有凉血止血,散瘀解毒消痈的功效。用于衄血,吐血,尿血,便血,崩漏,外伤出血,痈肿疮毒,是一味用药历史悠久的传统中药。研究表明大蓟的化学成分复杂,主要含黄酮类、长链炔醇类、挥发油类、三萜和甾体类化合物等。此外,大蓟的药理作用和临床应用广泛,研究认为黄酮类化合物是其主要的活性成分。然而,迄今为止有关中药大蓟的药代动力学研究还未见报道,其主要成分的代谢情况尚不清楚,因此,本文对大蓟主要黄酮类成分的吸收、分布、排泄以及体外代谢进行研究。建立大鼠口服大蓟提取物后血浆中7种黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷、柳穿鱼黄素、高车前素、香叶木素、刺槐素和芹菜素的HPLC-MS/MS检测方法,阐明相关药动学参数;建立大鼠口服大蓟提取物后柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素3种主要黄酮类成分在尿液、胆汁、粪便和各组织中的HPLC-MS/MS检测方法,研究其排泄规律和组织分布特征;采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对3种主要黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素的体外代谢进行研究。第一部分液质联用法同时测定大鼠血浆中7种黄酮类成分及其药代动力学研究目的:建立7种黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷、柳穿鱼黄素、高车前素、香叶木素、刺槐素和芹菜素在大鼠血浆中的HPLC-MS/MS检测方法,进行药动学研究。方法:色谱条件:反相Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),A(甲醇),B(0.1%甲酸-水)为流动相进行梯度洗脱,洗脱程序为0.0-1.5min 35%-65%A,1.5-6 min 65%A,6-8 min 95%A,流速为0.8 m L/min。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),源温度设为650℃。采用多反应监测模式(MRM)进行正负离子同时监测扫描。12只SD大鼠随机分为两组,给药后A组于0,2,5,10,15,25,60,90,120,180 min,B组于0,5,10,25,60,90,180,360,720,1140,1800 min眼内眦取血于肝素化离心管内,制备血浆,以磺胺甲噁唑为内标,样品处理采用甲醇沉蛋白法。结果:7种被测物质的线性关系良好(R2≧0.9954),大鼠给药后,柳穿鱼叶苷、蒙花苷、柳穿鱼黄素、高车前素、香叶木素和刺槐素的血药浓度于5 min达峰,Cmax分别为876.77±97.34 ng/m L,86.79±1.70 ng/m L,6.13±0.12 ng/m L,32.85±2.50 ng/m L,37.2±2.04 ng/m L和19.02±1.29ng/m L,且在180 min基本消除完全;芹菜素在360 min达峰,Cmax为148.26±20.63 ng/m L。芹菜素产生双峰现象,推测与肝肠循环有关。结论:本研究首次建立了一种灵敏的HPLC-MS/MS方法,同时测定了大鼠口服大蓟提取物后血浆中7种黄酮类成分的含量,并成功应用于药代动力学研究。结果表明,除芹菜素外,6种大蓟黄酮类成分在大鼠体内吸收和消除迅速。第二部分液质联用法同时测定大鼠尿液、胆汁和粪便中3种黄酮类成分及其排泄研究目的:建立大鼠口服大蓟提取物后,尿液、胆汁和粪便中3种黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素含量的HPLC-MS/MS测定方法,并研究排泄规律。方法:色谱条件:反相Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm),柱流动相为A(甲醇)-B(0.1%甲酸),梯度洗脱,洗脱程序如下:0.0-1.5min,35-90%A;1.5-4.5min,90-95%A;4.5-6.5min,95%A;6.6min,35%A。流速为0.8 m L/min。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),源温度设为650℃。采用多反应监测模式(MRM)进行正离子监测。大鼠按5 m L/kg灌胃给予大蓟提取物后,分别收集0-4,4-8,8-12,12-24,24-36,36-48 h时间段的尿液和粪便样品,胆管插管术后收集0-2,2-4,4-6,6-8,8-12,12-24,24-36 h时间段的胆汁样品,样品处理后分别测定。结果:柳穿鱼叶苷在24 h内经尿液、胆汁和粪便基本排泄完全,分别占总排泄量的94.52%、95.27%和99.14%,占给药量的0.07%、0.99%和14.96%。蒙花苷在24 h内经尿液、胆汁和粪便基本排泄完全,分别占总排泄量的97.53%、95.13%和99.66%,占给药量的0.047%,0.36%,10.50%。柳穿鱼黄素在36 h内经尿液和粪便基本排泄完全,分别占总排泄量的98.17%和99.98%,占给药量的2.21%和25.85%。柳穿鱼黄素在胆汁样品中未检测到。结论:本试验首次对大鼠口服大蓟提取物后,尿液、胆汁和粪便中的3种黄酮类成分的含量进行了测定,方法准确、可靠。3种黄酮类成分的主要排泄途径为经粪便排泄,柳穿鱼黄素不经胆汁排泄。第三部分大鼠口服大蓟提取物后柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素3种黄酮类成分的组织分布研究目的:建立大鼠口服大蓟提取物后心、肝、脾、肺、肾和脑中柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素含量的HPLC-MS/MS测定方法,并研究其组织分布特征。方法:色谱条件:反相Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相为A(甲醇)-B(0.1%甲酸),梯度洗脱,洗脱程序如下:0.0-1.5min,35%-90%A;1.5-4.5min,90%-95%A;4.5-6.5min,95%A;6.6min,35%A。流速为0.8 m L/min。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),源温度设为650℃。采用多反应监测模式(MRM)进行正离子监测。20只雄性SD大鼠,随机分为4组,按5 m L/kg灌胃给予大蓟提取物,依次于5 min,10 min,25 min,45 min处死,取出各组织,处理后测定各组织中柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素的含量。结果:柳穿鱼叶苷和蒙花苷在脾脏中含量最高,分别为960.76±130.72ng/g和350.76±62.44 ng/g,柳穿鱼黄素在肾脏中含量最高,为581.94±82.70ng/g,3种成分在各组织中均可检测到,在给药45 min后,含量显著下降。结论:本实验首次建立了一种HPLC-MS/MS方法对大鼠口服大蓟提取物后,各组织中柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素的含量进行了测定。结果表明3种黄酮类成分在血流丰富的器官含量较高,可通过血脑屏障,且在各组织中消除迅速,无长期蓄积现象。第四部分大蓟中3种黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素的体外代谢研究目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS法,考察柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素在大鼠肝微粒体中的I相和Ⅱ相体外代谢情况。方法:建立I相孵育体系,由0.1 mol/L K2HPO4缓冲液(p H 7.4)组成,其中含β-NADP 1.3 mmol/L,G-6-P 3.3 mmol/L,G-6-PD 1.0 U/m L,Mg Cl2 3.3 mmol/L,肝微粒体蛋白1 mg/m L;建立Ⅱ相孵育体系,由肝微粒体蛋白1 mg/m L,UDPGA 2 mmol/L,Mg Cl2 8 mmol/L,丙甲菌素25μg/m L,50 mmol/L Tris-HCl(p H=7.4)缓冲溶液组成。分别向孵育体系中加入待测物,启动反应,孵育结束后,应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS在IDA模式下对处理后的样品进行检测,并结合软件peakview1.2和Metabolitepilot1.5对结果进行分析。结果:柳穿鱼叶苷和蒙花苷各自检测到1个I相代谢产物M1、M2,柳穿鱼黄素检测到5个I相代谢产物M3、M4、M5、M6、M7,并对其结构进行了初步推测。3种成分均未检测到Ⅱ相代谢产物。结论:首次采用高分辨手段对柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素进行体外代谢研究,并阐明其代谢途径和代谢产物,3种黄酮类成分易生成I相代谢物,主要代谢产物为2-苯基色原酮母核的A环或B环失去-CH2的产物。3种成分均不发生葡萄糖醛酸结合反应。