背景及目的流行病学调查表明,各种脑转移肿瘤中以肺癌脑转移居多,约占全部病例的30~50%,尤其是小细胞肺癌在疾病早期就有脑转移的倾向。大约50~80%的小细胞肺癌患者在临床治疗后两年后出现脑转移。患者预后不良,平均生存期不足六个月。因此,寻找影响小细胞肺癌“嗜脑”的相关因子,阐明其分子机制对小细胞肺癌脑转移的防治具有重要的意义。脑组织缺乏淋巴管系统,因此血道转移成为肿瘤细胞进入脑组织的重要方式。与其他器官的肿瘤转移机制不同,发生脑转移的前提条件是肿瘤细胞需要穿越位于脑血管与脑实质间特殊的屏障系统——血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)。BBB主要由脑微血管内皮细胞、基膜、周细胞以及星形胶质细胞足突构成,其特殊的细胞间连接及解剖构成对于维系脑内微环境的稳态,限制外源性大分子物质及细胞进入脑实质发挥了重要作用。虽然有BBB这个特殊的“看门人”,但小细胞肺癌仍然表现出“嗜脑”性。依据Stephan Paget提出的“土壤与种子”学说,肿瘤脑转移的形成不是随机地,而是某些肿瘤细胞具有偏好神经系统的特性,肿瘤细胞这种偏好性是肿瘤异质性的体现。越来越多的证据表明,原发肿瘤细胞可以产生一些因子来影响继发转移器官的微环境,使经体循环而来的肿瘤细胞更容易在此“定居”,这种转移靶器官的微环境称为肿瘤转移前微环境(pre-metastasistic niche),也就是说肿瘤细胞可以通过相关因子特异性地远程调控移靶器官的微环境,营造一个适合肿瘤细胞生长的转移微环境,相对于肿瘤细胞来说这种靶器官的微环境具有时间和空间上的转换特点:当肿瘤细胞在原发部位而未到转移靶器官位点时,其为转移前微环境;当肿瘤细胞到达转移器官时,其转变为转移微环境。近年来的研究提示,来源于肿瘤细胞直径为30-100nm的外泌体被认为是肿瘤微环境最重要的“建设者”。外泌体最初被人们定义为真核细胞中运送胞内垃圾或碎片的囊泡结构,然而近些年来其作为细胞之间,细胞与微环境之间实现沟通的介质而倍受关注。外泌体内包含有来源细胞的多种生物活性分子,当其被靶细胞内吞后,外泌体内容物释放到靶细胞,从而改变靶细胞的多种生物学功能,进而改变转移靶器官的局部微环境,换句话说,器官特异性转移可能不仅取决于肿瘤细胞的内在的跨越生物屏障的能力,还取决于其对转移靶器官微环境的改建过程,如血管微环境体系的重塑。目前关于此方面的研究,尤其是来源于小细胞肺癌细胞的外泌体对脑内微环境的影响,尚未见相关文献报道。本课题组前期工作结果表明,小细胞肺癌患者原发癌组织中高表达Annexin A1;体外实验显示,与人脑微血管内皮细胞共培养后,小细胞肺癌细胞中Annexin A1表达水平上调,并且可以将Annexin A1分泌到细胞外;抑制小细胞肺癌细胞中Annexin A1的表达可以抑制裸鼠脑内转移瘤的形成。进一步的实验结果表明,小细胞肺癌细胞的外泌体介导了肿瘤源性的Annexin A1的外分泌过程。已有文献报道,肠上皮细胞释放的囊泡中包含有Annexin A1,并且在活动性的肠炎病患者血清来源的外泌体中Annexin A1处于高水平状态;包含有Annexin A1的囊泡将有助于损伤的肠上皮修复。但存在于小细胞肺癌细胞源性外泌体中的Annexin A1与脑转移,尤其是否影响脑内血管微环境的变化目前尚不可知。为此,我们纯化了小细胞肺癌细胞外泌体,首先探讨了来源于小细胞肺癌的外泌体是否通过血脑屏障进入脑内及其对转移前脑血管微环境的影响;其次探讨了当小细胞肺癌细胞与脑血管微环境相互作用时,存在于外泌体中的Annexin A1是否影响脑血管内皮细胞的功能及对进入脑内的肿瘤在脑内存活的作用。实验方法一、小细胞肺癌细胞源性外泌体对转移前脑血管微环境的作用1、利用超速离心的方法纯化不同肿瘤细胞培养上清中的外泌体,蛋白质免疫印迹及流式细胞仪技术鉴定外泌体相关蛋白分子marker,透射电镜观察其超微形态学特点,纳米微粒测量仪分析其囊泡直径大小。2、利用活细胞荧光染料分别标记人脑微血管内皮细胞及纯化的外泌体,利用激光共聚焦显微镜观察小细胞肺癌细胞源性外泌体被人脑微血管内皮细胞内吞情况。3、体外实验:用超速离心法提取小细胞肺癌细胞源性外泌体,处理人脑微血管内皮细胞,利用Metrigel血管生成实验观察血管生成情况,利用血脑屏障模型检测通透性情况。4、采用超速离心法提取Lewis肺癌细胞外泌体,利用小鼠立体定位仪行第三脑室注射C57小鼠8次后,多聚甲醛灌流后振动切片机制备脑组织切片,免疫荧光结合激光共聚焦荧光显微镜技术检测其脑组织CD31表达情况,观察脑血管分布改变。5、采用超速离心法提取Lewis肺癌细胞外泌体,行C57小鼠左心室内注射,每隔一天注射一次,连续8次后,收其脑组织样本,Western blot检测紧密连接相关蛋白表达情况。6、利用振动切片机将新生小鼠脑组织切成250-300μm厚的活体组织切片,建立活体脑组织体外培养体系(ex vivo)。7、利用超速离心法提取Lewis肺癌细胞外泌体,同体外培养的脑组织切片孵育,Western blot检测其紧密连接蛋白表达情况。二、小细胞肺癌源性外泌体如何介导Annexin A1调控人脑微血管内皮细胞的功能1、人源Annexin A1重组蛋白纯品处理人脑微血管内皮细胞后,MTS增殖试剂盒检测细胞增殖情况。2、人源Annexin A1重组蛋白纯品处理体外血脑屏障模型后,检测体外血脑屏障模型通透性变化情况。3、鉴于前期实验结果提示Annexin A1可以促进小细胞肺癌细胞粘附,利用Annexin A1重组蛋白处理人脑微血管内皮细胞后,Western blot及免疫荧光检测人脑微血管内皮细胞表面黏附分子Mac-1表达情况。4、利用细胞免疫荧光技术及Western blot检测人脑微血管内皮细胞中Annexin A1受体FPR1的表达及分布情况情况。5、超速离心法分离纯化小细胞肺癌细胞外泌体,进行LC-MS/MS蛋白质质谱分析外泌体中蛋白情况。6、超速离心法提取不同肿瘤细胞源性外泌体,Western blot检测Annexin A1在外泌体中存在情况。7、构建Annexin A1-flag真核重组表达载体,建立稳定高表达Annexin A1-flag的小细胞肺癌NCI-H446细胞株,G418筛选阳性细胞株,Western blot鉴定阳性细胞株中Annexin A1表达情况。8、利用慢病毒介导的RNAi干扰技术下调小细胞肺癌细胞中AnnexinA1的表达水平,嘌呤霉素筛选阳性细胞株,Western blot鉴定其下调效率。9、收集提取上述Annexin A1基因干预后的NCI-H446细胞源性外泌体,Western blot鉴定其中Annexin A1表达情况。将前述的NCI-H446细胞外泌体处理人脑微血管内皮细胞,观察血管生成情况。10、利用RNAi技术下调Lewis肺癌细胞Annexin A1表达,收集该细胞的外泌体,处理体外培养的活体脑组织切片,Western blot检测其紧密连接蛋白表达情况。三、含有Annexin A1的小细胞肺癌源性外泌体促进脑血管生成机制1、含有Annexin A1的小细胞肺癌细胞外泌体处理人脑微血管内皮细胞后,利用ELISAArray分析人脑微血管内皮细胞外分泌的细胞因子情况。2、用下调Annexin A1表达的小细胞肺癌细胞的外泌体处理人脑微血管内皮细胞后,利用ELISAArray分析其外分泌的细胞因子情况。3、综合1和2的内容筛选差异明显且与脑微血管生成相关的细胞因子。4、将获得的差异因子——CCL20处理人脑微血管内皮细胞,观察其血管生成情况,Western blot检测其紧密蛋白表达情况。5、人源CCL20重组蛋白纯品处理人小细胞肺癌细胞NCI-H446细胞,观察肿瘤细胞血管拟态形成情况。实验结果一、小细胞肺癌细胞源性外泌体对转移前脑血管微环境的作用1、利用超速离心的方法纯化不同肿瘤细胞(肺癌、乳腺癌、卵巢癌)培养上清液中的外泌体,蛋白质免疫印迹检测到外泌体标志分子CD63及CD9的表达,透射电镜可以观察到外泌体直径的大小在30nm左右,且外泌体囊泡具有双层膜结构,纳米颗粒直径分析仪测定外泌体直径为10-100nm范围,在15-20nm出现分布高峰;流式细胞仪技术分析结果证明小细胞肺癌细胞表面存在外泌体标志分子CD63,综上说明我们利用超速离心的方法获得了来源于肿瘤细胞的外泌体。利用Bradford蛋白质定量获得的外泌体浓度在0.5μg/μl至1.6μg/μl范围内。2、利用活细胞染料(CFDA-SE)预染人脑微血管内皮细胞,用BODIPY~?TR神经酰胺染料标记小细胞肺癌细胞源性外泌体,共同孵育后利用激光共聚焦显微镜观察到红色荧光标记的小细胞肺癌细胞源性外泌体可被绿色荧光标记的人脑微血管内皮细胞内吞到细胞内。3、小细胞肺癌细胞源性外泌体处理人脑微血管内皮细后,早期内皮细胞通透性增强,后期通透性无变化,且经外泌体处理后脑微血管内皮细胞逐渐形成分枝状、管状的结构,说明外泌体促进体外人脑微血管内皮细胞血管生成。4、超速离心法纯化Lewis肺癌细胞外泌体,于C57小鼠第三脑室注射后,免疫荧光检测其脑血管内皮标志分子CD31表达情况,结果表明外源进入脑内的Lewis肺癌细胞外泌体可以增加注射局部脑微血管密度,提示其具有促进脑微血管生成的作用。5、提取Lewis肺癌细胞外泌体,利用红色BODIPY~?TR神经酰胺染料标记后于C57小鼠左心室内注射后,可以在脑组织切片中观察到红色外泌体存在,说明外周血液循环中的Lewis肺癌细胞外泌体可以通过血脑屏障进入脑内,进一步的Western blot结果提示外泌体的进入脑组织后上调脑血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达,提示其具有促进脑微血管生成的作用。6、取新生小鼠,断颈处死后剥离脑组织,利用组织振动切片机将新生小鼠脑组织切成250-300μm厚的活体组织切片,置于Transwell培养小室中连续培养4天,仍可保证组织具有完整的结构,中心部脑组织无坏死和自溶现象发生,建立活体外新鲜脑组织培养体系(ex vivo)。7、提取Lewis肺癌细胞外泌体与体外培养的脑组织切片共培养后,Western blot结果提示Lewis肺癌细胞源性外泌体可使脑组织相关的紧密连接蛋白增加,提示其促进脑微血管生成的作用。二、小细胞肺癌源性外泌体如何介导Annexin A1调控人脑微血管内皮细胞的功能1、Annexin A1重组蛋白处理人脑微血管内皮细胞后,MTS增殖实验显示其对脑内皮细胞的增殖无明显影响。Annexin A1重组蛋白处理培养在Transwell上的脑微血管内皮细胞单层,渗透实验结果表明Annexin A1重组蛋白不影响脑内皮单层的渗透性。此外,Annexin A1重组蛋白处理人脑微血管内皮细胞相同时间后,Western blot结果表明粘附分子Mac-1表达水平并无明显变化,且免疫荧光实验结果也提示Annexin A1不影响人脑微血管内皮细胞表面Mac-1表达,流式细胞仪技术分析获得和前述相同的结果。这些结果表明,外分泌的Annexin A1可能不是通过细胞因子形式调控脑微血管内皮细胞的功能。2、免疫荧光及Western blot检测人脑微血管内皮细胞中FPR1的存在情况,结果表明,在人脑微血管内皮细胞表面无FPR1存在,这些结果进一步提示外分泌的Annexin A1可能不是通过细胞因子作用受体的模式调控脑微血管内皮细胞的功能。3、利用LC-MS/MS蛋白质质谱分析外泌体中蛋白情况,结果表明小细胞肺癌外泌体中存在Annexin A1。利用超速离心方法分离纯化不同肿瘤细胞上清中的外泌体,Western blot结果提示在获得的不同肿瘤外泌体中存在Annexin A1。4、构建Annexin A1-flag真核重组表达质粒,转染NCI-H446细胞,G418筛选出稳定高表达Annexin A1的NCI-H446细胞株;利用慢病毒介导RNAi技术下调NCI-H446细胞中Annexin A1的表达,嘌呤霉素筛选出低表达Annexin A1的阳性细胞株,Western blot结果证实阳性细胞株中Annexin A1的表达。5、超速离心法纯化上述Annexin A1下调细胞株的细胞外泌体,Western blot鉴定其中Annexin A1表达情况,结果表明NCI-H446细胞内下调Annexin A1后其外泌体中Annexin A1含量下降。6、超速离心法提取下调及高表达Annexin A1后的NCI-H446细胞外泌体将其处理人脑微血管内皮细胞,观察血管生成情况,与空白对照相比高表达Annexin A1细胞外泌体对血管生成有促进作用,下调Annexin A1后其无促进作用。7、Lewis肺癌细胞干扰Annexin A1表达,纯化其外泌体后同体外培养的脑组织切片孵育,Western blot检测其紧密连接蛋白claudin-5表达,结果表明,低表达Annexin A1的肺癌细胞外泌体对紧密连接蛋白claudin-5的表达水平无促进作用。三、含有Annexin A1的小细胞肺癌细胞源性外泌体促进脑血管生成机制1、利用ELISAArray分析小细胞肺癌细胞源性外泌体处理人脑微血管内皮细胞后,其上清液中外分泌的细胞因子情况,发现一个表达明显升高的细胞分泌因子CCL20。2、慢病毒介导的RNAi技术下调小细胞肺癌细胞Annexin A1的表达水平,收集其外泌体后处理人脑微血管内皮细胞后,利用ELISAArray检测发现其上清液中CCL20含量明显下降。3、利用人源CCL20重组蛋白处理HBMEC,可以明显诱导脑微血管生成,Western blot检测其紧密连接蛋白occludin表达水平,结果提示CCL20可以上调脑微血管内皮细胞内occludin的表达水平。这些结果提示CCL20可以促进脑血管的新生。4、利用人源CCL20重组蛋白处理培养在基质胶上的NCI-H446细胞,结果提示CCL20还可以促进NCI-H446细胞形成分枝和管状血管形态,即促进了肿瘤血管拟态的发生。结论1、小细胞肺癌细胞源性外泌体可以被脑微血管内皮细胞内吞,可以促进局部脑血管微环境血管新生,为肿瘤的到来提供丰富的“土壤”。2、人脑微血管微环境可以诱导小细胞肺癌细胞过表达AnnexinA1,AnnexinA1可以被小细胞肺癌细胞以存在于外泌体的形式分泌到细胞外环境中发挥作用。3、含有Annexin A1的小细胞肺癌外泌体进入人脑微血管内皮细胞后诱导脑微血管内皮细胞表达并分泌高水平的CCL20,CCL20诱导脑血管新生的同时又可以促进小细胞肺癌血管拟态的发生,帮助小细胞肺癌细胞在脑内形成克隆病灶。