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【目的】
肺纤维化，也称之为肺间质纤维化(， PFfibrosisp ulmonary )，是一种弥漫性肺部炎性疾病，由多种原因引起，病变部位主要累及肺间质以及肺泡上皮细胞和肺血管。主要病理改变有肺泡结构紊乱、弥漫性肺泡炎和肺纤维化，临床表现为进行性加重的呼吸困难，刺激性干咳，其发病特点主要包括限制性的通气功能障碍、低氧血症以及慢性、进行性、弥漫性肺间质的纤维化。临床发病率、死亡率高，高度影响到人们的生命健康安全，当下研究人员并未开发出十分有针对性的治疗药物。肺纤维化大鼠全基因组高通量测序分析发现，Notch1/Jagged1信号通路在肺纤维化中广泛存在。研究发现一些中药复方或单药能通过激活Notch1/Jagged1通路调节肺纤维化的发生发展。本实验基于国家自然科学基金“基于miRNA探讨加味补阳还五汤干预肺纤维化大鼠微血管新生的分子机制及物质基础研究(编号：81874442)”的研究结果，通过实验验证加味补阳还五汤对Notch这一通路的干预作用，进而在人胚肺成纤维细胞(MRC-5)通过TGF-β刺激造模前后分别给予加味补阳还五汤干预，应用si-RNA技术干预Notch/Jagged1通路表达，探讨加味补阳还五汤抗肺纤维化的具体作用机制及特点。
【方法】
1.肺纤维化大鼠全转录组高通量测序分析。选取12只7周SD大鼠随机分成两组，对照组和实验组各6只，模型组进行纤维化造模，空白组不予处理，处理28天后，断椎处理大鼠，取肺部组织分别保存于液氮和4%多聚甲醛固定液中，用于后续RNA测序和病理切片观察。切片HE染色证实肺纤维化造模成功与否。通过高通量测序对实验组和对照组进行测序和分析，分别对lncRNAs，mRNAs，circRNAs和miRNAs的表达模式进行了分析，同时对差异表到的ceRAN进行了筛选，同时进行GO和KEGG富集分析挖掘与纤维化相关的通路及基因。
2.加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织病理形态的实验观察。分为空白组,模型组,中药(加味补阳还五汤)组，强的松组。利用博来霉素复制肺纤维化大鼠模型。于第14天、28天分别观察各组大鼠的一般情况，肺组织大体形态改变，HE染色、masson染色情况，Westenblot、RT-PCR法检测大鼠肺组织中Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白及mRNA的表达。
3.加味补阳还五汤干预Notch信号通路对MRC-5细胞的调节机制。应用RNA干扰技术(siRNA)筛选出干扰效果最好的靶位点，分为正常细胞组、siRNA沉默Notch1组、单纯TGF-β刺激组、siRNA沉默后TGF-β刺激组以及加味补阳还五汤干预1h后给予TGF-β处理组、Notch1siRNA转染48小时后加入加味补阳还五汤1小时后给予TGF-β刺激组。细胞生化检测siRNA沉默Notch后细胞内Jagged1、Hes-1蛋白的表达；Westernblot、RT-PCR法检测各分组细胞内Notch1蛋白及mRNA的表达水平。
【结果】
1.肺纤维化大鼠全转录组高通量测序分析。
在本研究中，通过高通量测序对实验组和对照组进行测序和分析，对lncRNAs，mRNAs，circRNAs和miRNAs的表达模式进行了测序分析，同时对差异表达的非编码RNA进行了筛选，并进行GO和KEGG富集分析挖掘相关信号通路及基因。全转录组测序分析发现在肺纤维化大鼠中，Notchsignalingpathway信号通路被显著富集到(图2-6B)，其相关基因表达发生了明显的变化，猜测在肺纤维化的发生中，Notch信号通路具有重要的调节作用，抗纤维化药物发挥作用可能与干预这一通路密切相关，具体的调控机制需进一步进行验证，为后续实验提供了有利证据。
2.加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织病理形态的实验观察。
2.1HE染色示：与空白组相比较，各给药组第14d时肺组织依然保持相对完整，组织内部表现出轻微的水肿，相关炎性细胞的浸润情况明显，病变状态加味补阳还五汤组较强的松组轻；而发展到第28d时相关细胞表现出增生，胸膜等位置出现了胶原蛋白沉积状况，并能够观察到明显的肺纤维化趋势，加味补阳还五汤组纤维化程度较强其他组明显降低。
2.2Masson染色状态：与空白组对照，实验鼠的支气管的胶原层厚度很小，可以观察到一定颜色的纤维分布状态。而对于模型组来说，在第14d时内部不同肺泡的宽度变大，而在肺间质等位置都能够观察到成纤维细胞的出现，存在一定程度的蓝色形式的沉积情况；在第28d肺泡的结构呈现出高度破坏，肺间质维持可观察到束状或者其他形式的纤维沉积情况，发展为代表性的纤维化状态。加味补阳还五汤组肺组织纤维化程度较模型组明显降低，与强的松组相比亦明显改善。
2.3Westenblot结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肺组织内Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白明显升高(P＜0.01)，其中第28d蛋白的表达量升高最为明显；加味补阳还五汤组与强的松组各时间点Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白的表达量较模型组显著下降，其中加味补阳还五汤组第28天下降最明显，与强的松组相比具有统计学意义(P＜0.05)。药物组各时间点蛋白的表达量和模型组同期相比均降低。
2.4RT-PCR法结果可以看出，与正常组相比，模型组、强的松组、加味补阳还五汤组Notch1、Jagged1、Hes-1mRNA含量水平都显著提升，组内两两对比差异性明显，具有统计学意义(P＜0.05)；和模型组进行对比，相应地通过强的松、加味补阳还五汤干预后，Notch1、Jagged1、Hes-1mRNA相对表达量有所下降，其中以加味补阳还五汤组干预28天下降最明显，组内两两比较差异性明显(P＜0.05)，具有统计学意义。强的松组与加味补阳还五汤组同期组内相比，具有统计学意义。
3.加味补阳还五汤干预Notch信号通路对MRC-5细胞的调节机制。
3.1细胞生化检测siRNA沉默Notch后细胞内Jagged1、Hes-1蛋白的表达，结果提示：与正常细胞组相比，siRNA沉默Notch1组，细胞内Jagged1、Hes-1的表达出现明显降低，应用TGF-β造模后，细胞内Jagged1、Hes-1的表达出现明显升高，与模型组相比，应用Notch沉默后再给予TGF-β刺激后，细胞内Jagged1、Hes-1的表达有所下降，但是较正常组偏高。相比之下，较加味补阳还五汤组来说，不管有无运用siRNA沉默，和空白组方面进行比较，、Hes-1Jagged1的含量都出现了明显的升高，不过运用siRNA沉默组的数值明显低一些。
3.2Westernblot、RT-PCR检测发现与正常细胞组相比，siRNA沉默Notch1组、siRNA沉默后TGF-β刺激组细胞内Notch1表达均明显降低。与TGF-β刺激组相比，siRNA沉默Notch1组、siRNA沉默后TGF-β刺激组中细胞内Notch1表达降低更明显。加味补阳还五汤干预1h后给予TGF-β处理组、Notch-siRNA转染48小时后加入加味补阳还五汤1小时后给予TGF-β处理组中细胞内Notch1表达降低，其中后者明显低于单纯TGF-β刺激组。
【结论】
加味补阳还五汤能抑制Notch/Jagged1信号通路，下调Notch1信号表达水平以发挥保护作用，进而改善MRC-5细胞的纤维化水平，猜测加味补阳还五汤通过干预Notch/Jagged1信号转导通路来发挥抗纤维化作用，并且有一定的预保护作用。
肺纤维化，也称之为肺间质纤维化(， PFfibrosisp ulmonary )，是一种弥漫性肺部炎性疾病，由多种原因引起，病变部位主要累及肺间质以及肺泡上皮细胞和肺血管。主要病理改变有肺泡结构紊乱、弥漫性肺泡炎和肺纤维化，临床表现为进行性加重的呼吸困难，刺激性干咳，其发病特点主要包括限制性的通气功能障碍、低氧血症以及慢性、进行性、弥漫性肺间质的纤维化。临床发病率、死亡率高，高度影响到人们的生命健康安全，当下研究人员并未开发出十分有针对性的治疗药物。肺纤维化大鼠全基因组高通量测序分析发现，Notch1/Jagged1信号通路在肺纤维化中广泛存在。研究发现一些中药复方或单药能通过激活Notch1/Jagged1通路调节肺纤维化的发生发展。本实验基于国家自然科学基金“基于miRNA探讨加味补阳还五汤干预肺纤维化大鼠微血管新生的分子机制及物质基础研究(编号：81874442)”的研究结果，通过实验验证加味补阳还五汤对Notch这一通路的干预作用，进而在人胚肺成纤维细胞(MRC-5)通过TGF-β刺激造模前后分别给予加味补阳还五汤干预，应用si-RNA技术干预Notch/Jagged1通路表达，探讨加味补阳还五汤抗肺纤维化的具体作用机制及特点。
【方法】
1.肺纤维化大鼠全转录组高通量测序分析。选取12只7周SD大鼠随机分成两组，对照组和实验组各6只，模型组进行纤维化造模，空白组不予处理，处理28天后，断椎处理大鼠，取肺部组织分别保存于液氮和4%多聚甲醛固定液中，用于后续RNA测序和病理切片观察。切片HE染色证实肺纤维化造模成功与否。通过高通量测序对实验组和对照组进行测序和分析，分别对lncRNAs，mRNAs，circRNAs和miRNAs的表达模式进行了分析，同时对差异表到的ceRAN进行了筛选，同时进行GO和KEGG富集分析挖掘与纤维化相关的通路及基因。
2.加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织病理形态的实验观察。分为空白组,模型组,中药(加味补阳还五汤)组，强的松组。利用博来霉素复制肺纤维化大鼠模型。于第14天、28天分别观察各组大鼠的一般情况，肺组织大体形态改变，HE染色、masson染色情况，Westenblot、RT-PCR法检测大鼠肺组织中Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白及mRNA的表达。
3.加味补阳还五汤干预Notch信号通路对MRC-5细胞的调节机制。应用RNA干扰技术(siRNA)筛选出干扰效果最好的靶位点，分为正常细胞组、siRNA沉默Notch1组、单纯TGF-β刺激组、siRNA沉默后TGF-β刺激组以及加味补阳还五汤干预1h后给予TGF-β处理组、Notch1siRNA转染48小时后加入加味补阳还五汤1小时后给予TGF-β刺激组。细胞生化检测siRNA沉默Notch后细胞内Jagged1、Hes-1蛋白的表达；Westernblot、RT-PCR法检测各分组细胞内Notch1蛋白及mRNA的表达水平。
【结果】
1.肺纤维化大鼠全转录组高通量测序分析。
在本研究中，通过高通量测序对实验组和对照组进行测序和分析，对lncRNAs，mRNAs，circRNAs和miRNAs的表达模式进行了测序分析，同时对差异表达的非编码RNA进行了筛选，并进行GO和KEGG富集分析挖掘相关信号通路及基因。全转录组测序分析发现在肺纤维化大鼠中，Notchsignalingpathway信号通路被显著富集到(图2-6B)，其相关基因表达发生了明显的变化，猜测在肺纤维化的发生中，Notch信号通路具有重要的调节作用，抗纤维化药物发挥作用可能与干预这一通路密切相关，具体的调控机制需进一步进行验证，为后续实验提供了有利证据。
2.加味补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺组织病理形态的实验观察。
2.1HE染色示：与空白组相比较，各给药组第14d时肺组织依然保持相对完整，组织内部表现出轻微的水肿，相关炎性细胞的浸润情况明显，病变状态加味补阳还五汤组较强的松组轻；而发展到第28d时相关细胞表现出增生，胸膜等位置出现了胶原蛋白沉积状况，并能够观察到明显的肺纤维化趋势，加味补阳还五汤组纤维化程度较强其他组明显降低。
2.2Masson染色状态：与空白组对照，实验鼠的支气管的胶原层厚度很小，可以观察到一定颜色的纤维分布状态。而对于模型组来说，在第14d时内部不同肺泡的宽度变大，而在肺间质等位置都能够观察到成纤维细胞的出现，存在一定程度的蓝色形式的沉积情况；在第28d肺泡的结构呈现出高度破坏，肺间质维持可观察到束状或者其他形式的纤维沉积情况，发展为代表性的纤维化状态。加味补阳还五汤组肺组织纤维化程度较模型组明显降低，与强的松组相比亦明显改善。
2.3Westenblot结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肺组织内Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白明显升高(P＜0.01)，其中第28d蛋白的表达量升高最为明显；加味补阳还五汤组与强的松组各时间点Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白的表达量较模型组显著下降，其中加味补阳还五汤组第28天下降最明显，与强的松组相比具有统计学意义(P＜0.05)。药物组各时间点蛋白的表达量和模型组同期相比均降低。
2.4RT-PCR法结果可以看出，与正常组相比，模型组、强的松组、加味补阳还五汤组Notch1、Jagged1、Hes-1mRNA含量水平都显著提升，组内两两对比差异性明显，具有统计学意义(P＜0.05)；和模型组进行对比，相应地通过强的松、加味补阳还五汤干预后，Notch1、Jagged1、Hes-1mRNA相对表达量有所下降，其中以加味补阳还五汤组干预28天下降最明显，组内两两比较差异性明显(P＜0.05)，具有统计学意义。强的松组与加味补阳还五汤组同期组内相比，具有统计学意义。
3.加味补阳还五汤干预Notch信号通路对MRC-5细胞的调节机制。
3.1细胞生化检测siRNA沉默Notch后细胞内Jagged1、Hes-1蛋白的表达，结果提示：与正常细胞组相比，siRNA沉默Notch1组，细胞内Jagged1、Hes-1的表达出现明显降低，应用TGF-β造模后，细胞内Jagged1、Hes-1的表达出现明显升高，与模型组相比，应用Notch沉默后再给予TGF-β刺激后，细胞内Jagged1、Hes-1的表达有所下降，但是较正常组偏高。相比之下，较加味补阳还五汤组来说，不管有无运用siRNA沉默，和空白组方面进行比较，、Hes-1Jagged1的含量都出现了明显的升高，不过运用siRNA沉默组的数值明显低一些。
3.2Westernblot、RT-PCR检测发现与正常细胞组相比，siRNA沉默Notch1组、siRNA沉默后TGF-β刺激组细胞内Notch1表达均明显降低。与TGF-β刺激组相比，siRNA沉默Notch1组、siRNA沉默后TGF-β刺激组中细胞内Notch1表达降低更明显。加味补阳还五汤干预1h后给予TGF-β处理组、Notch-siRNA转染48小时后加入加味补阳还五汤1小时后给予TGF-β处理组中细胞内Notch1表达降低，其中后者明显低于单纯TGF-β刺激组。
【结论】
加味补阳还五汤能抑制Notch/Jagged1信号通路，下调Notch1信号表达水平以发挥保护作用，进而改善MRC-5细胞的纤维化水平，猜测加味补阳还五汤通过干预Notch/Jagged1信号转导通路来发挥抗纤维化作用，并且有一定的预保护作用。