【摘 要】
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目的:肝细胞癌是常见恶性肿瘤,目前肝癌的治疗效果不好,寻找更有效的治疗方法成为当前的研究热点。Ebp1为ErbB3主要胞内结合蛋白之一,其编码基因为人PA2G4。人体包括肝在内各个组织都有Ebp1的存在。大量文献显示,在前列腺癌、肝癌及口腔鳞癌等肿瘤中都可以见到Ebp1的异常表达。我们通过实验探究Ebp1对肝细胞癌恶性行为的影响及分子机制,为肝癌靶向药物的研发提供新思路。方法:1.通过CCLE数据
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目的:肝细胞癌是常见恶性肿瘤,目前肝癌的治疗效果不好,寻找更有效的治疗方法成为当前的研究热点。Ebp1为ErbB3主要胞内结合蛋白之一,其编码基因为人PA2G4。人体包括肝在内各个组织都有Ebp1的存在。大量文献显示,在前列腺癌、肝癌及口腔鳞癌等肿瘤中都可以见到Ebp1的异常表达。我们通过实验探究Ebp1对肝细胞癌恶性行为的影响及分子机制,为肝癌靶向药物的研发提供新思路。方法:1.通过CCLE数据库分析PA2G4(Ebp1)在多种癌症中的表达水平;使用Ualan和Oncomine数据库对比正常组织和肝细胞癌组织中PA2G4(Ebp1)表达差异;并通过Kaplan-Meier生存曲线分析PA2G4(Ebp1)表达高低与肝细胞癌的预后关系;利用STRING构建PA2G4(Ebp1)的PPI网络图。2.采用重组慢病毒转染方法敲低sk-hep1和HepG2细胞中Ebp1的表达,并用Western blot检验敲低水平。3.采用CCK-8方法检测sh-NC组及sh-Ebp1组的细胞存活及生长情况;采用软琼脂克隆形成实验、平板细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力;采用流式细胞术检测两组细胞生长周期;使用划痕实验检测迁移能力;采用裸鼠成瘤实验研究Ebp1在体内实验中对肿瘤增殖的影响。4.应用 Western blot 探究 sh-NC 组及 sh-Ebp1 组 PI3K/Akt/mTOR 信号通路相关基因蛋白表达水平,使用Akt抑制剂后,观察两组细胞的蛋白表达水平。结果:1.通过分析CCLE数据库显示,Ebp1在肝细胞癌中表达水平较高;分析Ualcan及Oncomine数据库显示了在Ebp1在肝细胞癌中的表达水平明显高于正常肝组织;Kaplan-Meier生存曲线分析显示Ebp1与肝细胞癌患者预后密切相关;利用STRING的PPI网络图显示Ebp1与PI3K/AKT/mTOR信号通路密切相关。2.慢病毒转染效率检测显示,Ebp1在sh-Ebp1组的表达明显低于sh-NC组,说明sk-hep1和HepG2细胞系的Ebp1基因沉默构建成功(P<0.0001)。3.CCK-8实验结果显示,sk-hep1和HepG2两种细胞系中sh-NC组细胞的细胞生长活力均明显高于sh-Ebp1组细胞。4.平板细胞克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验均表明,与sh-NC组相比,sk-hep1和HepG2细胞系的sh-Ebp1组增殖能力和集落形成能力显著下降(P<0.0001)。5.流式细胞术检测细胞周期结果表明,Ebp1基因沉默使sk-hep1细胞在G2期发生了细胞阻滞(P<0.01),使HepG2细胞在G1期发生了细胞阻滞(P<0.01)。6.划痕实验结果表明,敲低Ebp1后,sk-hep1(P<0.0001)和HepG2(P<0.001)细胞的迁移能力明显下降。7.裸鼠成瘤实验显示,sh-NC组与sh-Ebp1组相比皮下荷瘤体积明显增大,根据瘤体生长曲线表明,敲低Ebp1后,裸鼠瘤体生长速度变慢。8.沉默Ebp1后,Western blot检测结果显示p-AKT和p-mTOR表达下降(P<0.001)。结论:1.Ebp1基因沉默使肝细胞癌sk-hep1细胞和HepG2细胞增殖能力下降,并发生了细胞阻滞。2.Ebp1基因沉默使肝细胞癌sk-hep1细胞和HepG2细胞迁移能力下降。3.Ebp1基因沉默可以明显抑制裸鼠的瘤体生长,为临床转化提供基础理论支持。4.Ebp1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞增殖和迁移,为临床靶向药物的研发提供理论基础。
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