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脂肪酸是人类重要的营养来源,其中的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是人体重要的生理活性物质,PUFAs不仅是生物体的基本成分,同时也是生物体的生命活动代谢产物,PUFAs的合成是通过一系列FAD(Fatty acid desaturase)和脂肪酸延长酶的催化作用形成的。去饱和酶是PUFAs合成途径中的关键酶,它控制着PUFAs的不饱和程度。Δ6脂肪酸去饱和酶(Fatty acid desaturase,Δ6-FAD)和Δ9脂肪酸去饱和酶(Fatty acid desaturase,Δ9-FAD)是PUFAs合成途径的关键酶,都可将特定C-C单键催化成双键。本研究通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术得到中华绒螯蟹肝胰腺cDNA,再根据中华绒螯蟹Δ6-FAD(Δ6-FAD GenBank登录号:KP876058)和Δ9-FAD(Δ9-FAD Accession Number:JQ693685)基因的cDNA序列设计引物,分别得到中华绒螯蟹Δ6-FAD和Δ9-FAD基因的开放阅读框(ORF)。以此为材料,分别构建酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,验证Δ6和Δ9-FAD的功能。并通过SDS-PAGE和Western-blotting、气相色谱-质谱联用(GC_MS)等试验方法对实验结果进行分析验证。酿酒酵母表达系统使用酵母INVSC1,选取表达载体pYES2,分别根据Δ6和Δ9-FAD的ORF和载体p YES2的序列,设计引物,每对引物上加上6xHis标签,通过PCR得到含有6xHis标签的Δ6和Δ9-FAD目的基因序列,分别特定的快切酶,酶切目的基因和载体,再通过T4DNA连接酶连接,得到重组质粒并送公司测序验证。将测序正确的重组质粒电转入酵母感受态细胞中,在SC-U固体培养上30℃基培养24-36h,挑取阳性菌株,进行酵母菌液PCR,将条带正确的菌液送去测序验证,将测序正确的菌株分别在16℃,25℃,30℃诱导表达,并在24h,48h,72h,96h取样,样品经处理后用经Westernblot分析和GC-MS检测。Δ6和Δ9-FAD基因在酿酒酵母中的表达结果显示:分别将含有Δ6和Δ9-FAD基因的重组质粒转化酿酒酵母后,样品处理后经Westernblot检测,并没有目的蛋白条带;测定脂肪酸,添加外源LA和ALA的Δ6-FAD诱导表达组以及不添加任何外源底物的表达组没有检测到γ-亚麻酸(γ-Linolenic Acid,GLA)或十八碳四烯酸(C18:4);同时,添加外源底物硬脂酸(C18:0)的Δ9-FAD诱导表达组以及不添加任何外源底物的表达组都没有检测到油酸(C18:1)。毕赤酵母表达系统选取酵母GS115,选pPIC3.5K为Δ9-FAD的表达载体,选取pPICZαA为Δ6-FAD的表达载体。分别根据Δ6和Δ9-FAD的ORF和各自对应的载体的序列,设计引物,每对引物上加上His标签,通过PCR得到含有His标签的Δ6和Δ9-FAD目的基因序列,分别用特定的快切酶,酶切目的基因和载体,再通过T4DNA连接酶连接,得到重组质粒;经Sac1线性化后,将重组质粒电转入酵母细胞中,并经过不同浓度梯度抗性筛选,获得高拷贝的转化株,并挑取阳性菌株测序验证,将测序正确的菌株在30℃诱导表达,并在48h取样检测。Δ6和Δ9-FAD基因在毕赤酵母中的表达结果显示:成功构建了含有Δ6和Δ9-FAD基因的重组毕赤酵母表达菌株,在不同诱导条件下培养,菌样经Westernblot检测,Δ6-FAD诱导表达组在60KD处检测到目的蛋白表达,并经质谱鉴定为Δ6-FAD蛋白,至此成功将Δ6-FAD在毕赤酵母中表达。