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目的探讨四君子汤调节2型糖尿病(T2DM)小鼠及大鼠糖脂代谢紊乱的药效学变化以及筛选其降糖调脂活性部位,通过网络药理学筛选四君子汤调节T2DM糖脂代谢紊乱的可能作用机制,实验验证四君子汤是否通过调节PI3K/AKT信号通路(网络药理学筛选得到)保护T2DM大鼠肝脏从而达到调节糖代谢紊乱。方法1四君子汤药液的制备及制备控制:以D-葡萄糖为对照品,采用苯酚-浓硫酸比色法测定四君子汤中总多糖的含量;以芦丁为对照品,采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定四君子汤中总黄酮的含量;以甘草酸为对照品,采用1%香草醛乙酸-高氯酸比色法测定四君子汤中总皂苷的含量。以总多糖、总黄酮和总皂苷含量的综合评分为指标,采用单因素实验结合正交试验法优选四君子汤的最佳提取工艺;采用单因素实验结合响应曲面法优选四君子汤的最佳纯化工艺。2考察四君子汤对T2DM小鼠糖脂代谢紊乱的调控作用:采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导建立小鼠T2DM胰岛素抵抗模型。实验设空白组、模型组、阳性组、四君子汤高剂量(SJZT-H)、四君子汤中剂量(SJZT-M)和四君子汤低剂量(SJZT-L)组,考察对小鼠体质量(W)、肝脏指数、口服葡萄糖耐量(OGTT)、空腹血糖(Fasting blood-glucose,FBG)含量、空腹胰岛素(FINS)含量、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、总胆固醇(T-CHO)含量、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量、甘油三酯(TG)含量和肝糖原(Liver Glycogen,LG)含量的影响。3筛选四君子汤调节T2DM小鼠糖脂代谢紊乱的活性部位:实验设空白组、模型组、阳性药组、四君子汤水提液(SJZT)组、四君子汤水提醇沉物(SJZT-D)组和四君子汤水提醇沉上清液液(SJZT-U)组。考察小鼠W、OGTT、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR、T-CHO含量、LDL-C含量、HDL-C含量、TG含量和LG含量。4四君子汤调节T2DM大鼠糖代谢紊乱的药效研究及活性部位筛选:实验设空白组、模型组、阳性药组、SJZT组、SJZT-D组和SJZT-U组。考察大鼠W、肝脏指数、OGTT、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR、LG含量、NO含量、SOD活性、肝脏组织形态及病理切片。5通过网络药理学筛选四君子汤调节T2DM糖代谢紊乱的可能作用机制:依据TCMSP数据库、PubChem数据库、SwissTargetPrediction数据库筛选四君子汤的活性成分,并预测其作用靶点;依据TTD数据库、DRUGBANK数据库、DisGeNET数据库筛选T2DM作用靶点;成分靶点与疾病靶点映射后借助Cytoscape软件构建四君子汤成分-靶点网络,根据自由度筛选核心有效成分-核心靶点,通过DAVID数据库对核心靶点基因进行GO分析和KEGG分析;最后对相关度前3蛋白对相关度前5成分进行分子对接。6通过实验验证网络药理学筛选的作用机制:实验设空白组、模型组、阳性药组、SJZT组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测大鼠肝脏INSR、IRS-1、PI3K、AKT、FOXO1、GSK-3β的表达。结果1四君子汤药液的制备及制备控制:四君子汤总多糖、总黄酮、总皂苷的方法学考察显示,总多糖、总黄酮、总皂苷分别在6.54~43.6 ug/mL、4.36~109 ug/ml、10.9~272.7ug/ml范围内呈现良好的线性,精密度、稳定性、重复性试验RSD均小于3.00%,加样回收率分别为104.28%,102.235%,100.18%,RSD<3.00%;优选的四君子汤的最佳水提工艺条件为加水量10倍,煎煮时间90分钟,煎煮3次;四君子汤的最佳醇沉工艺条件为醇沉浓度85%,浓缩液相对密度1.25g/mL,静置时间14h。2考察四君子汤对T2DM小鼠糖脂代谢紊乱的调控作用:与空白组相比,模型组小鼠W、AUC、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR、T-CHO含量以及肝脏指数极显著(P<0.001)升高,TG含量显著(P<0.01)升高,LDL-C含量明显(P<0.05)升高,LG含量极显著(P<0.001)降低,HDL-C含量明显(P<0.05)降低;与模型组相比,SJZT-H组小鼠W、AUC、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR以及肝脏指数极显著(P<0.001)降低,T-CHO含量、TG含量显著(P<0.01)降低,LG含量极显著(P<0.001)升高;SJZT-M组小鼠AUC、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR极显著(P<0.001)降低,T-CHO含量、TG含量明显(P<0.05)降低,LG含量极显著(P<0.001)升高;SJZT-L组小鼠HOMA-IR极显著(P<0.001)降低,AUC、FINS含量显著(P<0.01)降低,LG含量明显(P<0.05)升高。3筛选四君子汤调节T2DM小鼠糖脂代谢紊乱的活性部位:与空白组相比,模型组小鼠W、AUC、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR以及T-CHO含量极显著(P<0.001)升高,TG含量显著(P<0.01)升高,LG含量极显著(P<0.001)降低,HDL-C含量明显(P<0.05)降低;与模型组比较,SJZT组小鼠AUC、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR含量极显著(P<0.001)降低,TG含量、T-CHO含量明显(P<0.05)降低,LG含量极显著(P<0.001)升高;SJZT-U组小鼠AUC显著(P<0.01)降低,FINS含量、T-CHO含量明显(P<0.05)降低;SJZT-D组小鼠AUC、FBG含量、FINS含量、HOMA-IR极显著(P<0.001)降低,LG含量极显著(P<0.001)升高。4四君子汤调节T2DM大鼠糖代谢紊乱的药效研究及活性部位筛选:与空白组相比,模型组大鼠AUC、FBG含量、HOMA-IR极显著(P<0.001)升高,肝脏指数显著(P<0.01)升高,FINS含量明显(P<0.05)升高,W、LG含量极显著(P<0.001)降低,SOD活性明显(P<0.05)降低,大鼠肝脏颜色变黄,质变脆,肝细胞脂肪变性严重;与模型组比较,SJZT组大鼠AUC极显著(P<0.001)降低,FBG显著(P<0.05)降低,LG含量极显著(P<0.001)升高;SJZT-D组大鼠AUC、FBG含量、NO含量明显(P<0.05)降低,LG含量极显著(P<0.001)升高,SOD活性明显(P<0.05)升高;SJZT-U组大鼠LG含量明显(P<0.05)升高;各给药组大鼠颜色、质地、肝细胞组织变性的到不同程度的改善。5通过网络药理学筛选四君子汤调节T2DM糖代谢紊乱的可能作用机制:从四君子汤中筛选出113个化学成分,涉及治疗糖尿病的47个靶点;根据节点自由度≥平均自由度,筛选出核心成分22个,核心靶点27个;GO分析结果表明其涉及血糖稳态、脂肪组织发育的正调控等7个生物过程,涉及类固醇激素受体活化、药物结合等4个分子功能,包括质膜、核常染色质2个细胞组成;KEGG分析结果表明其可能主要通过AMPK信号通路、PPAR信号通路、胰岛素抵抗等7个信号通路治疗糖尿病有关。分子对接60%具有强烈的结合活性,40%具有较好的结合活性。6通过实验验证网络药理学筛选的作用机制:与空白组比较,模型组大鼠INSR、IRS-1、PI3K、AKT2、mRNA相对表达量极显著(P<0.001)降低,FOXO1、GSK-3βmRNA相对表达量极显著(P<0.001)升高;与模型组相比,SJZT组大鼠PI3KmRNA相对表达量极显著(P<0.001)升高,IRS-1、AKT2mRNA相对表达量明显(P<0.05)升高,INSRmRNA相对表达量升高,FOXO1、GSK-3βmRNA相对表达量极显著(P<0.001)降低。结论采用紫外分光光度法测定四君子汤中总多糖、总黄酮和总皂苷的含量,简便易行、准确可靠。优选出的最佳提取纯化工艺稳定可行,为四君子汤的给药药液质量控制提供科学依据。四君子汤中高剂量组均能显著改善2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗,促进胰岛素功能的恢复,同时可以调节糖脂代谢紊乱。大鼠及小鼠部位筛选结果同时表明降糖调脂有效部位为水煎液。网络药理学研究发现四君子汤通过多靶点、多通路治疗2型糖尿病,选择PI3K/AKT信号通路进行验证。验证发现四君子汤能通过激活肝脏PI3K/AKT信号通路改善2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗,促进肝糖原的合成以及葡萄糖氧化分解,达到调节糖代谢紊乱的效果。